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1、1.2 基因工程的基本操作程序,2018/9/6,1,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,基因工程基本操作的四个步骤,有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用,载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。,才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。,1.2基因工程的基本操作程序,原核细胞的基因结构(补充内容）,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,不编码蛋白质。
2、,：编码蛋白质 ,连续不间断,编码区,非编码区,原核细胞的 基因结构,调控遗传信息表达,上游有启动子，下游有终止子,启动子,真核细胞的基因结构（补充内容）,编码区,与RNA聚合酶 结合位点,内含子,外显子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列 内含子：不能编码蛋白质的序列,：有调控作用,上游有启动子，下游有终止子,非编码序列：,包括非编码区和内含子,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,连续,不连续,编码区,非编码,（一）、目的基因主要是指,编码蛋白质的基因,一、目的基因的获取,即：将需要的基因从供体生物细胞内提取出来,目前被广
3、泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因等。也可以是一些具有调控作用的因子,2018/9/6,6,(二)获得目的基因的方法,从基因文库中获取目的基因,利用PCR技术扩增目的基因 人工合成,2018/9/6,7,1、从基因文库中直接获取,（1）基因文库,未知序列,将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。,（2）基因文库的分类,含有一种生物的全部基因,只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库,某种生物的单链mRNA,单链互补DNA,双链cDNA片段,导入受体菌中储存,与
4、载体连接,cDNA文库,反（逆）转录酶,DNA聚合酶,cDNA的合成流程图解,基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较,依据：目的基因的有关信息。（课本）,如：根据 基因的核苷酸序列 基因的功能、基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因的表达产物蛋白质等特性。,（4）获取目的基因的根据,（3）构建基因文库的目的,为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。,（2）原理：,DNA复制,2、利用PCR技术扩增目的基因,一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。,（3）前提：,已知序列,2018/9/6,13,引物：是一小段单链DNA（或RNA），作为DNA
5、复制的起始点，一般所说引物，指DNA引物。,何为引物？,（4）过程：,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从引物的5端3端延伸，合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,2018/9/6,14,（5）方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循环的次数）,（6）结果：,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,2018/9/6,16,具体过程,PCR(多聚酶链式反应),（8）PCR技术扩增与DNA复制的比较,碱基互补配
6、对,四种脱氧核苷酸,模板、能量、酶,DNA在高温下变性解旋,解旋酶催化,体外复制,细胞核内,热稳定的DNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶,大量的DNA片段,形成整个DNA分子,目的基因的mRNA,单链DNA (cDNA）,双链DNA (即目的基因),反转录,合成,(1)反转录法：以目的基因的mRNA为模板反转录成互补的单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,目的基因,推测,推测,化学合成,(2)根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：,3、人工合成的目的基因,基因较小已知序列,使目的基因在受体细胞中稳
7、定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。, 核心,二、基因表达载体的构建,1、目的：,（1）用一定的_切割质粒，使其出现一个切口，露出_。（2）用_切断目的基因，使其产生_。, 核心,（3）将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,二、基因表达载体的构建,2018/9/6,22,质粒,DNA分子,限制酶处理,一个切口 两个黏性末端,两个切口 获得目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）, 核心,同一种,二、基因表达载体的构建,2、过程:,2018
8、/9/6,23,科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。,资 料:,2018/9/6,24,问题：基因表达载体需要有什么才能表达？,3、基因表达载体的组成：,2018/9/6,25,启动子： 终止子：（见课本）,二者都属于基因表达载体的一部分。,三、将目的基
9、因导入受体细胞,（一）转化：,目的基因进入_内，并且在受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,（二）方法,1、将目的基因导入植物细胞的方法： （1）农杆菌转化法 农杆菌特点：,易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力,原理：农杆菌的Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,过程：,优点：经济有效,（2）基因枪法-适合单子叶植物（3）花粉管通道法,2、将目的基因导入动物细胞 方法：显微注射法 程序：,目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵） 显微注射 受精卵 新性状动物,3、将目的基因导入微生物细胞（ Ca2+法）原核生物特点：繁殖快、
10、单细胞、遗传物质少 方法：,用Ca2+处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子,三、将目的基因导入受体细胞,（二）方法,将目的基因导入 植物细胞,将目的基因导入 动物细胞,将目的基因导入 微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,Ca2+处理法,四、目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,（一）、检测,1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 (关键步骤),.首先取出转基因生物的基因组DNA.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中,（1
11、）方法:,DNA分子杂交,（2）过程:,归纳步骤,（二）、鉴定（个体生物学水平）,2、检测目的基因是否转录出了mRNA,3、检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法:,分 子 杂 交,方法:,抗原抗体杂交,过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA,原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,编码区：,能转录，编码蛋白质,非编码区：,不编码蛋白质,能调控遗传信息表达,2018/9/6,37,真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,非编码区,启动子,终止子,编码
12、区上游,编码区下游,内含子,外显子,与RNA聚合酶结合位点,编码区：,非编码区：,外显子：,内含子：,能编码蛋白质的序列,不能编码蛋白质的序列,2018/9/6,38,1）以下说法正确的是 （ ）A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接D、基因控制的性状都能在后代表现出来,C,练习,2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是A、能复制 （ ）B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因D、它是环状DNA,D,练习,3）有关基因工程的叙述中，错误的是（ ）A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来
13、B、 限制性内切酶用于目的基因的获得C、目的基因须由运载体导入受体细胞D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶,A,练习,4）有关基因工程的叙述正确的是 （ ）A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,D,练习,5）基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 （ ）A、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达,C,练习,2、下列属于获取目的基因的方法的是( ) 利用mRNA反转录形成从基因组文库中提取 从
14、受体细胞中提取 利用PCR技术 利用DNA转录 人工合成 A. B. C. D.,1、 在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是（ ）个,A. 540 B. 8100 C. 17280 D. 7560,2018/9/6,44,3.细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因在基因工程中的主要作用是 A提高受体细胞在自然环境中的耐药性 B有利于对目的基因是否导入进行检测 C增加质粒分子的分子量 D便于与外源基因连接4. 有关基因工程的叙述正确的是 A限制酶只在获得目的基因时才用 B重组质粒的形成是在细胞内完成的 C质粒都可作为运载体 D蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,2018/9/6,45,5.哪项不是基因表达载体的组成部分( )A.启动子 B.终止密码C.标记基因 D.目的基因 6. (2008,全国高考)已知某种限制酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点。如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的DNA片段。现有多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶酶切后，这些线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种数是,
