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1、微生物基因工程,李刚 副教授,教学内容,一、PCR引物的设计与实验操作技巧； 二、基因组文库的建立与筛选； 三、定向进化技术在微生物酶制剂研究中的应用； 四、原核表达系统的选择和高效表达策略； 五、真核表达系统的选择和高效表达策略。,四、原核表达系统的选择和高效表达策略,原核生物表达系统主要包括：大肠杆菌表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统等, 其中应用最广泛的是大肠杆菌表达系统。,原核表达系统的优点,1、细菌培养操作简单、生长繁殖快、价格 低廉； 2、外源基因表达产物的水平高( 如大肠杆菌中目的蛋白的表达量可超过细菌总蛋白量的80%) ； 3、基因背景和表达特性清楚。,大肠杆菌表达
2、系统,自20 世纪70 年代以来, 大肠杆菌一直是基因工程中应用最为广泛的表达系统。尤其是进入后基因组时代以来, 有关蛋白结构以及功能研究的开展, 对基因表达的要求更高, 这时大肠杆菌往往是表达的第一选择。,大肠杆菌表达系统的优缺点,优点： 大肠杆菌具有培养条件简单、生长繁殖快、安全性好、 可以高效表达不同外源基因产物等特点, 是许多外源基因 表达系统中最好的一种, 是目前研究最深入、发展也最完善的表达系统, 大量的有价值的多肽和蛋白质已在大肠杆菌中获得了超量表达。 缺点： 大肠杆菌表达体系与其他表达体系相比, 也具有一些缺 点: 高效表达易形成包涵体。不能进行翻译后的加工修饰, 如糖基化、磷
3、酸化及酰基化等。,大肠杆菌表达系统的操作流程,大肠杆菌表达系统操作的一般程序如下： 获得目的基因准备表达载体将目的基因插入表达载体中（测序验证）转化表达宿主菌诱导靶蛋白的表达表达蛋白的分析扩增、纯化、进一步检测。,大肠杆菌表达系统的基本概念,首先讲述一些大肠杆菌表达的基本概念：一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株，如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂，如果是融合表达还包括纯化系统或者Tag检测等等。选择表达系统通常要根据实验目的来考虑，比如表达量高低，目标蛋白的活性，表达产物的纯化方法等等。主要归结在表达载体的选择上。 表达载体：我们关心的质粒上的元件包括启动子，多克隆位点，终止密码
4、，融合Tag（如果有的话），复制子，筛选标记/报告基因等。通常，载体很贵，我们可以通过实验室之间交换得到免费的载体。但是要小心，辗转多个实验室和多个实验室成员之手的载体是否保持原来的遗传背景？MCS是否还是原来那个MCS？是我们要特别注意的。,大肠杆菌表达系统的基本概念,复制子：通常表达载体都会选用高拷贝的复制子。pSC101类质粒是严谨方式复制，拷贝数低，pCoE1，pMBI(pUC)类的复制子的拷贝数高达500以上，是表达载体常用的。通常情况下质粒拷贝数和表达量是非线性的正相关，当然也不是越多越好，超过细胞的承受范围反而会损害细胞的生长。如果碰巧需要2个质粒共转化，就要考虑复制元是否相容的
5、问题。 筛选标记和报告基因：氨苄青霉素抗性是最常见的筛选标记，卡那霉素或者是新霉素次之，四环素，红霉素和氯霉素等已经日渐式微。抗性基因的选择要注意是否会对研究对象产生干扰，比如代谢研究中要留意抗性基因编码的酶是否和代谢物相互作用。在表达筛选中要注意的问题应该就是LB倒板前加抗生素的温度，温度过高容易导致抗生素失效。今天耐青霉素的超级细菌泛滥，不知道是否有我们实验人员的功劳呢？大家“随便倒掉”已经获得氨苄抗性的大肠杆菌之前有没有经过煮沸或者消毒等处理呢？从以前的一针50万单位到现在100多万个单位，青霉素剂量似乎越来越大了。,大肠杆菌表达系统的基本概念,对于做表达来说，如果不是要研究启动子的强弱
6、，通常比较少关心或者用到报告基因吧。绿色荧光蛋白是最常用的报告基因了（注意选择适用原核表达版本的GFP），其他还有半乳糖苷酶，荧光素酶等等。一些融合表达Tag也有报告基因的功能。 启动子、终止子和核糖体结合位点： 启动子：启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之一。从转录模式上看有组成型表达和诱导调控型表达。lac和Tac，PL和PR，T7是最常用的启动子。 转录终止子对外源基因在大肠杆菌中的高效表达有重要作用控制转录的RNA长度提高稳定性，避免质粒上异常表达导致质粒稳定性下降。放在启动子上游的转录终止子还可以防止其他启动子的通读，降低本底。转录终止子有两类，分别是Rho因子作用下使mRNA
7、转录终止的终止子和根据模版上的对称序列形成发夹结构而终止mRNA转录的终止子。常见的是rrnB 、rRNA操纵子的T1T2串连转录终止子。,大肠杆菌表达系统的基本概念,核糖体结合位点：启动子下游从转录起始位点开始延伸的一段碱基序列，其中能与rRNA16S亚基3端互补的SD序列对形成翻译起始复合物是必需的，多数载体启动子下游都有SD序列，也有些载体没有，适合自带SD序列的基因表达，要留意。,大肠杆菌表达系统的几种表达方式,组成型表达：表达载体的启动子为组成型启动子，也就是一直努力不停表达目的蛋白的启动子，如pMAL系统。持续性表达通常表达量比较高，成本低，但是不适合表达一些对宿主细菌生长有害的蛋
8、白。因为过量或者有害的表达产物会影响细菌的生长，反过来影响表达量的积累。 诱导调控型表达：表达载体采用诱导型启动子，只有在诱导剂存在的条件下才能表达目的产物。这种方法有助于避免菌体生长前期高表达对菌体生长的影响，又可减少菌体蛋白酶对目标产物的降解。特别适合解决有毒蛋白的表达。另外也有启动子是组成型的，但是启动子所依赖的转录酶是诱导表达的，也属于诱导表达系统。,大肠杆菌表达系统的几种表达方式,融合表达：表达载体的多克隆位点上有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。对于特别小的分子建议用较大的Tag（如GST）以获得稳定表达；而一般
9、的基因多选择小Tag以减少对目的蛋白的影响。His-Tag是最广泛采用的Tag。分泌表达：在起始密码和目的基因之间加入信号肽，可以引导目的蛋白穿越细胞膜，避免表达产物在细胞内的过度累积而影响细胞生长，或者形成包涵体，而且表达产物通常是可溶的活性状态，不需要复性。通常这种分泌只是分泌到细胞膜和细胞壁之间的周质空间。可溶性表达：大肠杆菌表达效率很高，特别是强启动子，目的蛋白来不及折叠而形成不溶的包涵体颗粒，包涵体容易纯化但是复性效率不高。分泌表达可以得到可溶的产物，也有部分融合Tag有助于提高产物的可溶性，比如Thio，pMAL系统。,提高大肠杆菌表达系统重组蛋白可溶性的策略,大致有八种策略： （
10、1）在细胞中表达分子伴侣（天然或异源），辅助新生肽链折叠，避免肽链相互聚合（例如Takara的Chaperone plasmid Set）； （2）共表达折叠酶，催化共价键形成； （3）通过降低培养温度和摇床速度来降低蛋白合成速度，以降低有聚合倾向的中间体的浓度； （4）选择中等强度或低强度的启动子代替强启动子，降低重组蛋白的合成速度； （5）选择适合的宿主菌株； （6）表达含可溶性多肽或信号肽的重组蛋白，提高可溶性； （7）蛋白质的可溶性往往与自身的氨基酸序列有关，因此可利用诱突技术改变其氨基酸序列，提高目的蛋白的可溶性；（8）诱导过程中加入化学物质，以增加渗透压或改变培养基的pH值。,大肠
11、杆菌表达系统中几个常用的启动子,最早应用于大肠杆菌表达系统的是Lac乳糖操纵子，由 启动子Plac、操纵基因lacO和结构基因组成。其转录受CAP正调控和lacI负调控。lacUV5突变能够在没有CAP的存在下更有效地起始转录，该启动子在转录水平上只受lacI的调控，因而随后得到了更广泛采用。lacI产物是一种阻遏蛋白，能结合在操纵基因lacO 上从而阻遏转录起始。乳糖的类似物IPTG可以和lacI产物结合，使其构象改变离开lacO，从而激活转录。这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表达系统载体构建的常用元件。,大肠杆菌表达系统中几个常用的启动子,tac启动子是trp启动子和lacUV5的拼接杂
12、合启动子，且转录水平更高，比lacUV5更优越。trc启动子是trp启动子和lac启动子的拼合启动子，同样具有比trp更高的转录效率和受lacI阻遏蛋白调控的强启动子特性。在常规的大肠杆菌中，lacI阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身的lac操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高的本底表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq突变菌株常被选为Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。,大肠杆菌表达系统中几个常用的启动子,现在的Lac/Tac/trc载体上通常还带有lacIq 基因，以表达更多lacI阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。IPTG广泛用
13、于诱导表达系统，但是IPTG有一定毒性，有人认为在制备医疗目的的重组蛋白并不合适，因而也有用乳糖代替IPTG作为诱导物的研究。另外一种研究方向是用lacI的温度敏感突变体，30度下抑制转录，42度开启转录。热诱导不用添加外来的诱导物，成本低，但是由于发酵过程中加热升温比较慢而影响诱导效果，而且热诱导本身会导致大肠杆菌的热休克蛋白激活，一些蛋白酶会影响产物稳定。,大肠杆菌表达系统中几个常用的启动子,以噬菌体载体转录启动子PL、PR 构建的载体也为大家所熟悉。这两个强启动子受控于噬菌体cI基因产物。cI基因的温度敏感突变体cI857(ts)常常被用于调控PL、PR启动子的转录。同样也是30度下阻遏
14、启动子转录，42度下解除抑制开发转录。同样的，PL、PR 表达载体需要携带cI857(ts)菌株作为表达载体，现在更常见的做法是在载体上携带cI857(ts)基因，所以可以有更大的宿主选择范围。另外一种思路是通过严谨调控cI产物来间接调控PL、PR启动子的转录。比如Invitrogen的PL表达系统，就是将受trp启动子严谨调控的cI基因溶源化到宿主菌染色体上，通过加入酪氨酸诱导抑制trp启动子，抑制cI基因的表达，从而解除强大的PL启动子的抑制。,大肠杆菌表达系统中几个常用的启动子,T7启动子是当今大肠杆菌表达系统的主流，这个功能强大兼专一性高的启动子经过巧妙的设计而成为原核表达的首选，尤其
15、以Novagen公司的pET系统为杰出代表。强大的T7启动子完全专一受控于T7 RNA 聚合酶，而高活性的T7 RNA 聚合酶合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍当二者同时存在时，宿主本身基因的转录竞争不过T7表达系统，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。由于大肠杆菌本身不含T7 RNA 聚合酶，需要将外源的T7 RNA 聚合酶引入宿主菌，因而T7 RNA 聚合酶的调控模式就决定了T7系统的调控模式非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录，从而避免目的基因毒性对宿主细胞以及质粒稳定性的影响；通过控制诱导条件
16、控制T7 RNA 聚合酶的量，就可以控制产物表达量，某些情况下可以提高产物的可溶性部分。,常用的几种大肠杆菌表达系统,1、GE（原安玛西亚）-pGEX系列，特点：使用该系列载体可以很方便进行下一步重组蛋白的纯化。,GE（原安玛西亚）-pGEX系列,Invitrogen- Champion pET Expression System等四个系列,比起其它公司的原核表达系列来说Invitrogen有个非常突出的地方就是它的重组克隆技术。像之前Novagen大部分载体都是用传统的酶切、链接方式做重组质粒，但是Invitrogen的表达系统大量运用了它的TOPO技术和Gateway技术。 Invitro
17、gen公司总共有四个原核表达系统它们分别是：Champion pET Expression System、HisPatch ThioFusion System、pBAD Inducible Bacterial System、pL System和T7-based Systems。这四个系列的载体可谓把原核表达的发展史中出现过的几种启动子都囊括进去了，包括T7、pL、pBAD和trc启动子，同时几种经典的调控方式也都出现了，包括有乳糖操纵子、色氨酸操纵子和阿拉伯糖操纵子。 Champion pET Expression System之所以取了个冠军系统的称号是因为它结合了经典的T7表达系统和Invitrogen的王牌定向TOPO技术及Gateway技术，这可谓是强强联手。,
