冯学亮教授

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1、百令胶囊菌种鉴定报告 及抗肾纤维化作用的研究,西安交大医学院第一附属医院 冯学亮 2009年10月27日,冬虫夏草,冬虫夏草是一种昆虫和真菌的复合体.被寄生的虫体是虫草蝙蝠蛾的幼虫.寄生的真菌是冬虫夏草菌(cordyceps sinensis (BerK.)Sacc.),它属于真菌门,子囊菌纲,肉座菌目,麦角菌科,虫草菌属,冬虫夏草种.,8月左右雪线以 下，阴坡半阴坡,5月5-15日,8-9月间 3-10摄氏度,子囊孢子,感染蝙蝠蛾幼虫,菌核（10月 到次年五月, 菌丝束）,子座,7月下旬,子囊成熟,分生孢子,长出牙管,僵虫,冬虫夏草生活史,形成僵虫过程,23天内,长出牙管,冬虫夏草生活史,公

2、元780年，藏医药学名著月王药诊：“治肺部疾病”。,1757年，清吴仪洛本草从新“冬虫夏草味甘性平，入肺肾二经，保肺益肾、补精髓、止血化痰，已劳嗽，治膈症皆良。”,1765年，清赵学敏本草纲目拾遗“冬虫夏草治膈症、蛊胀。”,冬虫夏草的药用价值,古代70多部中药学文献把冬虫夏草的功用归纳为:“能阴阳并补，治劳嗽膈症，诸虚百损；功与人参、鹿茸同，但药性温和，老少病虚者皆宜食用。“,同时，新中国建立以来，我国有200多部药书详细记载了冬虫夏草的药效与用途。,冬虫夏草的药用价值,冬虫夏草的有效成分,虫草酸（甘露醇）、虫草素（腺苷）、虫草多糖、腺嘌呤、尿嘧啶、多球壳菌素;,维生素B1、B2、B12、E等

3、;,还有人体必需的微量元素锌、锰、钾、磷等;,以及多种必需的氨基酸等。,虫草酸：具有促进机体新陈代谢，清除自由基，抗过氧化损伤作用； 虫草素：具有抗菌.抗癌活性的核苷类物质，对核多聚腺苷酸聚合酶有很强的抑制作用。抑制细菌和癌细胞生长。清除自由基，抗过氧化损伤作用,还有一定的降血糖作用; 虫草多糖：能促使淋巴细胞转化，提高血清IgG的抗体含量和机体的免疫功能，增强机体自身抗癌,抑癌的能力。抗纤维化作用; 腺 苷：具有舒张血管、降低血压、减慢心律,对心律有双向调节作用;,冬虫夏草野生资源逐年萎缩,据统计，20世纪50年代以前全国年产量曾达100吨以上，60年代初为50吨至80吨，到90年代仅有5吨

4、至15吨。,虽然有关部门将冬虫夏草列为国家二级保护物种，各地政府也出台政策禁挖、限挖，但对冬虫夏草的采挖并未得到遏制。,目前世界上已发现同属“虫草属”的虫草已有三百五十种之多，其中在中国已发现过六十余种，包含：,冬虫夏草和虫草,冬虫夏草（C.sinensis） 北冬虫夏草(C.militaris) 大团虫草（C.ophioglossoides） 亚香棒虫草(C.hawkesii) 古尼虫草(C.gunnii) 珊瑚虫草(C.martialis) 镰刀状虫草(C.falcata) 泰山虫草(C.taishanensis） 山西虫草(C.shanxiensis) 凉山虫草(C.liangshane

5、nsis) 新疆虫草(C.gracilis) 香棒虫草(C.barnesii) 等,冬虫夏草和虫草,冬虫夏草和虫草,冬虫夏草和虫草,金龟子虫草,黄蜂虫草,大团囊虫草,珊瑚虫草,虽然已发现的品种繁多，但其中具有药用价值的品种却并不多；有些还具有毒性，错误服用后可能会直接破坏人体的肌体功能。,冬虫夏草和虫草,冬虫夏草虽然药用价值较高，但因其数量有限，价格过于昂贵, 毕竟不能进入寻常百姓之家。,中科院微生物研究所开展的冬虫夏草及其相关类群的分子系统学分析的课题已经证明：百令胶囊生产菌就是天然冬虫夏草的无性型。,冬虫夏草VS百令胶囊,从已知的化学成分看,其生物活碱、甾醇、甘露醇、微量元素、氨基酸的含量

6、和百分比都与天然冬虫夏草一致。,冬虫夏草及其相关类群的分子 系统学分析,魏鑫丽 ,印象初 ,郭英兰 ,沈南英 ,魏江春 2006年 第25卷 第02期,国家创新经费赞助(编号0110),实验背景,药用真菌的物种科学名称是否准确,是一个国家真菌科学水平的标志,更是能否保护我国自主知识产权的关键。,中华束丝孢与中国被毛孢是否等同？印象初院士于2001年10月18日上午约魏江春院士交谈上述问题，建议魏江春院士能主持澄清上述学术争议问题。,中国科学院真菌与地衣系统学开放实验室1990年的学术委员会年会上立项问题。,Hirsutella hepiali chen et shen,sp.nov 中国被毛孢

7、（百令） Paecelonvyces hepiali 蝙蝠蛾拟青霉（金水宝） Mortierella hapialia 蝙蝠蛾被孢霉（至灵） Cephalosporium dongchongxiacao 虫草头孢菌（宁心宝） 等等。,市场上冬虫夏草菌种很多，也很混乱,人工虫草,研究目标,中华束丝孢与冬虫夏草之间的亲缘关系？,亲缘关系？,蝙蝠蛾拟青霉与冬虫夏草之间的亲缘关系？,亲缘关系？,研究目标,无论是至灵、宁心宝和心肝宝胶囊的生产菌均非冬虫夏草菌的无性型,分子水平一致,供试材料编号、名称、产地及提供者,总DNA提取： 采用改良CTAB法（Rogers & Bendich, 1988）。,DN

8、A随机扩增多型性(RAPD)分析,扩增反应：955分钟，1个循环，94，1分钟，361分钟，72 2分钟，40个循环；最后722分钟。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，80V，2小时。,随机引物的选用： 从华美公司试剂盒中选择了6个随机引物： S23（AGTCAGCCAC）， S33（CAGAACCCAC）， S61（TTCGAGCCAG）， S146（AAGACCCCTC）， OPW-06（AGGCCCGATG）， OPV-14（AGATCCCGCC）。,RAPD反应体系（25l）含有：25mM MgCl2 1.5l，2.5mM dNTP 1.5l，10M 引物2l，10Buffer 2.

9、5l，3U/l Taq酶0.5l，模板（稀释50倍）0.5l，无菌去离子水16.5l。,6个随机引物的图谱,利用PAUP分析6条引物的RAPD图谱所得的树型图（Distance method；bootstrap=1000；UPGMA），节间数字代表bootstrap值。,分子水平一致,PCR扩增、测序及分析： 通过PCR从供试菌株总DNA中进行核rDNA ITS区 (ITS1-5.8S-ITS2)碱基序列的扩增；引物选用ITS4和ITS5 (White et al., 1990)；PCR产物由上海博亚和基康公司测序。测序结果利用软件DNAMAN 4.0进行比对；利用Mega 2进行系统学分析（

10、Kumar et al., 2001）；采用Kimura 2-parameter模式，存在缺失时成对删除；构建系统关系树采用NJ 法，重复运算1000次（bootstrap=1000）。,nrDNA间隔区(ITS)序列分析,rDNA gene 结构模式图,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,细菌,古菌,真核生物,保守区(相似性70%以上),高变区,16S,16S,ISR,23S,ISR,23S,17S-18S,5.8S,ITS1,ITS2,25S-28S,中间省略,分子水平一致,分子水平一致,节间数字代表bootstrap值（低于50因不是同一类群而未标识）。,分子水平一致,

11、冬虫夏草 Cordyceps sinensis 中国被毛孢 Hirsutella sinensis,蝙蝠蛾拟青霉 Paecilomyces hepiali,蛹草拟青霉 Paecilomyces militaris,建议,鉴于具有创新性发现, 为了保护知识产权, 提出下列建议：,I、百令胶囊： 1、将百令胶囊生产菌的菌种名称尽快更正为:中国被毛孢（Hirsutella sinensis Liu et al. ） 2、将百令胶囊的成分更正为：冬虫夏草发酵菌粉,II、金水宝胶囊： 1、鉴于具有创新性发现, 建议将金水宝胶囊生产菌蝙蝠蛾拟青霉的拉丁学名 Paecilomyces hepiali Che

12、n et Dai（不合格名称）尽快进行合格化发表, 以实现该名称的合法性，从而得到保护名称和自主知识产权的。 2、将金水宝胶囊成分更正为：蝙蝠蛾拟青霉发酵菌粉,III、为国家药监部门提出建议,百令在基础和临床方面的研究日益受到关注。90年代以来在国家级的杂志上作为论著文章累计150余篇。主要临床功用体现在以下方面：,百令在医学领域的广泛应用,肾内科：有效改善肾功能，拮抗肾纤维化。 移植科：促进细胞增生，防治CsA肾毒性。 呼吸科：降低气道阻力，提高肺顺应性。 肝 科：抗纤维化，抗氧化。 肿瘤科：拮抗毒性，升白，提高机体免疫功能。 内分泌：治疗自身免疫性甲状腺疾病。 等等,虫草菌液拮抗马兜铃酸对

13、人近端肾小管上皮细胞的作用,芮宏亮 谌贻璞等 中华肾脏病杂志 2006年8月第22卷第8期,国家自然科学基金项目(No.30170429) 卫生部属(管)医疗机构临床学科重点项目(2005-2007年度),方法及材料,采用体外培养的肾小管上皮细胞系HKC细胞。,马兜铃酸钠盐(AA)刺激细胞浓度为40mg/ml。,冬虫夏草菌液由杭州中美华东制药有限公司提供。刺激细胞时药物浓度为10mg/ml。,此二种药物试验前均已进行细胞增殖作用及毒性效应检测(MTT试验及LDH试验)。,芮宏亮 谌贻璞等, 中华肾脏病杂志 2006年8月第22卷第8期,实验指标,CTGF是TGF-发挥前纤维化活性的一个重要 下

14、游因子。,PAI,tPA,TIMP,纤溶酶,MMP,ECM降解,芮宏亮 谌贻璞等, 中华肾脏病杂志 2006年8月第22卷第8期,实验流程,HKC细胞,A:对照组,B:虫草菌液组,C:马兜铃酸组,D:马兜铃酸 虫草菌液组,刺激12小时后,刺激36小时后,裂解细胞，用RT-PCR测定TGF-1、 CTGF、PAI-1和TIMP-1mRNA表达,收集上清，用ELISA法测定TGF-1、 PAI-1和TIMP-1蛋白质表达 裂解细胞，用Western blot测定 CTGF蛋白质表达,统计、分析,芮宏亮 谌贻璞等, 中华肾脏病杂志 2006年8月第22卷第8期,TGF-1 mRNA 表达变化,A,B

15、,C,D,-Actin,TGF-1,A组：对照组,B组：虫草菌液组,C组：AA组,D组：AA+虫草菌液组,M,TGF-beta1 mRNA,*,#,芮宏亮 谌贻璞等, 中华肾脏病杂志 2006年8月第22卷第8期,TGF-1 蛋白质表达变化,A组：对照组,B组：虫草菌液组,C组：AA组,D组：AA+虫草菌液组,TGF-beta1 (ng/L),*,#,*,芮宏亮 谌贻璞等, 中华肾脏病杂志 2006年8月第22卷第8期,CTGF mRNA 表达变化,-Actin,CTGF,A,B,C,D,M,CTGF mRNA,*,#,A组：对照组,B组：虫草菌液组,C组：AA组,D组：AA+虫草菌液组,芮宏亮 谌贻璞等, 中华肾脏病杂志 2006年8月第22卷第8期,CTGF 蛋白质表达变化,-Actin,CTGF,A,B,C,D,Relatively CTGF Folds,*,#,*,A组：对照组,B组：虫草菌液组,C组：AA组,D组：AA+虫草菌液组,芮宏亮 谌贻璞等, 中华肾脏病杂志 2006年8月第22卷第8期,PAI-1 mRNA 表达变化,-Actin,PAI-1,A,B,C,D,M,PAI 1 mRNA,与对照组比较 *p0.05,(n=3),*,*,A组：对照组,B组：虫草菌液组,C组：AA组,D组：AA+虫草菌液组,