《05生物化学实验--聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质》由会员分享，可在线阅读，更多相关《05生物化学实验--聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质（8页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质【目的】1 掌握圆盘电泳分离血清蛋白的操作技术。2 熟悉 聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。【原理】带电粒子在电场中向着与其自身电荷方向相反的电极移动，称为电泳。聚丙烯酰 胺凝胶电泳（ PAGE ）就是以聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质的电泳。在电泳时， 蛋白质在介质中的移动速率与其分子的大小，形状和所带的电荷量有关。聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，是由丙烯酰胺（ Acr ）单体和少量交 联剂 N,N- 亚甲基双丙烯酰胺（ Bis ） 在催化剂过硫酸铵（ Ap ）和加速剂四 甲基乙二胺 （ TEMED ） 的作用下发生聚合反应而制得的（其化学结构式见第 2 篇第 1 章
2、）。聚丙烯酰胺凝胶具有网状结构， 其网眼的孔径大小可用改变凝胶液中单体的浓度 或单体与交联剂的比例来加以控制。根据血清蛋白分子量的大小， 学生实验一般 选用 7 聚丙烯酰胺凝胶分离血清蛋白质。不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳利用浓缩效应、分子筛效应和电荷效应的三重作用分 离物质（见第 2 篇第 1 章）， 使样品分离效果好，分辨率较高。一般醋酸纤 维薄膜电泳只能把血清蛋白质分离出 5 7 条带， 而聚丙烯酰胺凝胶电泳却能 分离出十几条到几十条来（图 3-4 ），是 目前较好的支持介质，应用十分广 泛。图 3-4 血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱根据凝胶支持物的形状不同，分为垂直板电泳和盘状电泳两种，二者
3、原理相同。 本实验采用的盘状电泳是在直立的玻璃管中，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶 作为支持物，采用电泳基质的不连续体系， 使样品在不连续的两相间积聚浓缩 （浓 缩效应）成厚度 为 10 -2 cm 的起始区带，然后再利用分子筛效应和电荷效 应的双重作用在分离胶中进行电泳分离。【器材】1 电泳仪直流稳压电源，电压 400 500V ，电流 50mA 。2 垂直管型圆盘电泳装置目前这类装置的种类很多， 可根据不同的实验要求选择其中的一种。这类装置均 由两个基本的部分组成， 一部分为载胶玻璃管， 须选用内径均匀（ 5 6mm ） , 外径 7 8mm ，长 80 100mm 的玻璃管作为材料，也可
4、以使用更细的玻璃 管。另一部分为电泳液槽，可分为上下两槽。电泳时，上下两槽通过凝胶柱沟 通电流（图 3-5 ）。图 3-5 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A 为正面， B 为剖面 ) 3 大号试管和中号试管4 微量移液器5 5ml 注射器和 9 号注射针头6 洗耳球、滤纸条、封口膜等【试剂】1 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺一般性的分析工作， 用分析纯的 Acr 和 Bis 即可，精细的分析工作， 尤其是分 子量的测定和定量分析，需商品 Acr 和 Bis 进行重结晶，进一步纯化。2 N ， N ， N ， N 四甲基乙二胺（ TEMED ）商品 TEMED 即可，低温，避光保存。3 10% 过硫酸
5、铵溶液（ AP ， W/V ）10g 过硫酸铵定容到 10ml ，最好使用新鲜配制的溶液。4 染色液取三氯乙酸 200 g 加水 500ml ，然后加入 10 g 考马斯亮蓝 R 250 用玻璃棒 搅拌，待完全溶解后，再加入蒸馏水加至 1000ml 。5 脱色液的配制取三氯乙酸 100 g 加蒸馏水溶解后加至 1000ml 。6 储备液的配制电极缓冲液、凝胶缓冲液及凝胶储备液配制见下表：浓缩胶缓冲液Tris 5.98g 1mol/L HCl 48ml 加蒸馏水至 100ml PH 6.7 凝胶储液Acr 30.0g Bis 0.8g 加蒸馏水至 100ml 分离胶缓冲液Tris 36.3g 1
6、mol/LHCl 48ml 加蒸馏水至 100ml PH 8.9 凝胶储液Acr 30.0g Bis 0.8g 加蒸馏水至 100ml 10 电极缓冲液Tris 6g Gly 28.8g 加蒸馏水至 1000ml PH 8.3 储液配制好后放冰箱4 冷藏备用，用时 10 倍稀释，学生用时大约 3 天需 更换一次。7 凝胶液的配制分离胶和浓缩胶的配制见下表：7% 分离胶配制（ ml ）3% 浓缩胶配制（ ml ）双蒸水13.5 双蒸水5.7 凝胶储液7 凝胶储液1 PH 8.9 缓冲液7.5 PH 6.7 缓冲液1.3 1%TEMED 2 1%TEMED 2 总体积30 总体积10 8 20%
7、蔗糖100ml 取蔗糖 20g ，加少许蒸馏水溶解，最后加至 100 ml 。9 加样缓冲液的配制 ( PH6.7 ) 取 1mol 盐酸 4.8 ml ， Tris 0.6g ， 20% 蔗糖溶液 40ml ，加水至 80ml 充 分混匀后，再加入 0.02g 溴酚蓝，4 保存备用。【操作】1 凝胶系统的聚合和制备一般先制备分离胶，然后再在分离胶上面制作浓缩胶。（ 1 ）电泳玻璃管的准备取一根洁净的电泳玻璃管， 垂直放在青霉素瓶盖的凹穴中或用封口膜密封，备用。（ 2 ）分离胶（小孔胶）的制备取分离胶 3ml 放入试管，加入 100 l 10% Ap 溶液混匀后使用。用微量移液器抽取胶液小心迅
8、速加入到玻璃管内，当加到液面距离电泳玻璃管上 口 2cm 时停止（约 1.6ml ）。注意在加的过程中不要混进空气，用过的注射器 和针头要及时用水清洗，防止堵塞。再在其上面小心覆盖 0.5cm 高的蒸馏水层 （约 0.2ml ）以隔绝空气， 并防止柱 表面的弯月面。 加水过程中不要用力过猛， 防止将液面胶液冲起。 刚加入水层时 在水层和胶面的交接处可见一明显的折光面，此折光面会逐渐消失， 等再次出现 时标志分离胶聚合已经开始，应使玻璃管垂直静置约 1520 分钟后，完成凝胶 的聚合过程。然后用滤纸小心吸去表面的水层，切勿破坏胶面的完整性。（ 3 ）浓缩胶（大孔胶）的制备取浓缩胶 1ml 放入试
9、管，加入 50 l 10%Ap 溶液混匀后使用。用微量移液器吸取少量浓缩胶缓冲液漂洗一下分离胶的胶面，用滤纸吸取残留的 缓冲液，滤纸尽量不要接触胶表面。再加入约 1cm 高的浓缩胶（约 0.25ml ），表面也覆盖一层蒸馏水。刚加入水 层时在水层和胶面的交接处可见一明显的折光面，此折光面会逐渐消失， 等再次 出现时标志浓缩胶聚合已经开始，聚合 2030 min 后除去上面的水层，同样不 要破坏胶面的完整性。吸去水层后用电泳缓冲液漂洗胶面，再用电泳缓冲液注满至管口， 在室温下放置 1020 min 后即可使用了。2 样品的制备和点样（ 1 ）样品的准备：取兔血清 0.5ml ，加入 3ml 加样
10、缓冲液混合。可在4 冰箱保存 2 周。（ 2 ）点样：将制好的胶管装入电泳槽中调节高度并塞紧，防止电泳中产生漏 液。然后分别在电泳槽的上下槽体内注入电泳缓冲液，下槽的液面应没过玻璃管 的下管口（注意不要有气泡存在）和电极丝；上槽的液面应没过玻璃管口 0.5 1cm 。用微量注射器吸取 50 l 样品；标准蛋白样品 1 份（蛋白质含量 1mg/ml ，溶于加样缓冲液中） 小心的加入玻璃管内， 注意不要让样品溢出管口。4 电泳（ 1 ）电流电压条件圆盘电泳：直流稳流电流强度通常为 4mA/ 管 。（ 2 ）电泳时间一般约需 3 小时。样品中溴酚蓝电泳至距分离胶前缘约 1cm 处时即可停止电 泳。5
11、 剥胶电泳结束后，取下玻璃管，用带长针头的注射器（内盛蒸馏水）从浓缩胶一端紧 贴玻璃管壁缓慢插入针头， 一面注入蒸馏水一面缓慢旋转玻璃管。靠水流的压力 和润滑作用使凝胶和玻璃管的内壁分开，待水流从另一端流出时， 再慢慢将针头 退出（注意操作中不要把胶条搅碎）。然后用洗耳球轻轻在胶管的一端加压，将 胶条从玻璃管中缓慢滑出。6 染色和脱色剥胶完毕后，将胶条放入染色液中过夜（ 16 小时以上）。将胶条以自来水冲 洗两次，然后在脱色液中脱色约 5 分钟，共两次。7 结果分析脱色完全后，从脱色槽中取出凝胶（小心折断或撕裂），观察区带的数量及迁移 率。如果需定量，可进行区带扫描，计算出各区带中蛋白质的含量
12、。【注意事项】1 制胶时必须以封口膜将管下口封严密，加 AP 后立即灌胶。2 灌凝胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流的通过。3 电泳时，电泳仪与电泳槽间正、负极不能接错，以免样品反方向泳动，电泳 时应选用合适的电流、电压，过高或者过低都会影响电泳效果。4 电泳时，为保证电泳结果满意，最好使用新稀释的缓冲液。5 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用， 操作时宜带 手套，纯化应在通风柜中进行。【思考题】1 聚丙烯酰胺凝胶作为电泳支持物，有何优缺点？2 哪些因素可以影响凝胶的聚合？3 为什么在样品中加含有少许溴酚蓝的 40 蔗糖溶液？蔗糖及溴酚蓝各有 何用途？附：1 不同浓度聚丙烯
13、酰胺凝胶的配制，见表 3 -2 。表 3-2 不同浓度聚丙烯酰胺凝胶的配制分离胶浓度试剂名称配制 30ml 不同浓度分离胶液所需试剂量（ ml ）配制 10ml 3% 浓缩胶7% 10% 12% 15% 20% 分离 胶储备液缓冲液7 7.5 10 7.5 12 7.5 15 7.5 20 7.5 浓缩 胶储备液缓冲液- - - - - - - - - - 1.0 1.25 1%TEMED 蒸馏水2 13.3 2 10.3 2 8.3 2 5.3 2 0.3 2 5.65 以上各液加入后，为了去除抑制凝胶聚合的氧， 在加入 Ap 之前应进行抽气处理。10% 过硫酸胺0.2 0.2 0.2 0.
14、2 0.2 0.1 2 几种染料的性能及染色原理（ 1 ）氨基黑 10B(amino black 10B) C 22 H 13 O 12 N 6 S 3 Na 3 ， MW=715, max=620 630mm 。氨基黑是酸 性染料，其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐。是最常用的蛋白质染料。 缺点是灵 敏度不太高，对 SDS 蛋白质染色效果不好，对不同的蛋白质着色度不同，色 调不一（有蓝、黑、棕等）。（ 2 ）考马斯亮蓝 R 250 (Comassie brilliant blue R 250 ) ：C 45 H 44 O 7 H 3 S 2 Na ， MW=824 ， max=560 590mm
15、 ，原理与氨基 黑相似，灵敏度比氨基黑高 5 倍。尤其适用于 SDS 电泳微量蛋白质染色。 但蛋 白质浓度超出一定范围时，对高浓度蛋白质的染色不合乎 Beer 定律。（ 3 ）考马斯亮蓝 G 250 ：比考马斯亮蓝 R 250 多 2 个甲基， MW=854 ， max=590 610mm 。染色的 灵敏度不如 R 250 ，但比氨基黑高 3 倍，优点在于它在三氯乙酸中不溶解成胶 体，能选择地染蛋白质而几乎无本底色。所以常用于需重复性染色和稳定性的染 色，适于定量分析。聚丙烯酰胺不连续盘状电泳和垂直板电泳基本原理是相同的。后者适用于需要对 比性分析的样品的电泳分析。 这项电泳技术 （ PAGE ）由于能够使样品区带浓缩 变窄，所以分辨力高、设备简单、样品量小（ 1 100g ）；时间短，操作 方便，可分离生物大分子的分子大小范围广泛，可结合 SDS 后进行亚基分析和 分子量测定。这种方法目前几乎代替了超速离心沉降法。PAGE 的用途较广，对生物大分子能进行分离、 定性、定量分析，又能用于制备 mg 水平的材料。3 蛋白质染色方法（表 3-3 ）表 3-3 蛋白质染色方法方 法固 定 液染 液染 色 时 间 脱 色氨基黑 10B 甲醇或7% 乙酸0.1mol/L 氢氧化钠 - 1% 氨基
