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1、针对植酸酶基因转入猪的唾液腺设计一条技术路线一、有关植酸酶植酸酶是 微生物分泌的催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸（盐）的一类酶的总称，属磷酸单酯水解酶。植酸酶具有特殊的空间结构， 能够依次分离植酸分子中的磷，将植酸（盐）降解为肌醇和无机磷，同时释放出与植酸（盐）结合的其它营养物质。植酸酶的作用：能使饲料中植物有机磷得到有效地利用猪、鸡等单胃动物体内缺少内源植酸酶，所以不能有效地利用植酸磷。美国肯塔基大学经过 10 年研究证实， 猪只能利用玉米中磷的10% 12% ，豆粕中磷的 2535% ；而鸡对玉米和豆粕中磷的利用率比猪还低，显然85左右的磷从粪便中排出，污染环境。在不同饲料中添加不同水平植
2、酸酶可以使磷的利用率提高30300。减少磷污染添加植酸酶能改善畜禽生长性能大量实验表明，在肉鸡饲料中添加植酸酶以有明显增重效应，并改善饲料利用率，降低料肉比；在猪饲料中添加植酸酶，猪增重明显提高，料肉比减少。增加矿物元素利用率在低磷或正常磷含量的日粮中添加植酸酶后，不仅促进了植酸磷的生物利用率，而且增加了钙、镁、锰、铜、锌、铁以及氮的生物利用率，其中钙、锌、锰、铜特别明显。并且促进了动物矿质营养的平衡，特别是钙、磷平衡和铜平衡。促进了动物对蛋白质、氨基酸及碳水化合物的消化吸收添加植酸酶能改善猪回肠的氮和氨基酸的消化率以及氮存留。诺丁汉大学的研究表明植酸酶使回肠的氮消化率从55% 提高到 68，
3、整个消化道氮的消化率从81% 提高到 68% 。正是由于植酸酶具有上述一举多得的功效，目前已成为饲料工业中的热点。由于不能有效吸收利用植酸磷，生产实践中必需在猪、禽等饲料中人为添加一些额外的磷以满足畜牧生产中的畜禽对磷的需求。而添加的磷往往是过量的，再加上原本饲料中不能利用的磷的存在，导致了多余的磷随动物的粪便排出体外，严重污染环境。如果能使动物体内能够产生植酸酶，就能充分利用饲料中的植酸磷，降低饲养成本，提高饲料利用率。 因此，产生了把植酸酶基因转入猪体内，使猪自身能产生植酸酶的设想。二、 技术路线1、获取外源目的基因即选取能够得到较高品质和较高含量植酸酶的基因序列作为目的基因。从大肠杆菌基
4、因组中克隆， 或者从黑曲霉基因组中克隆 （较多人进行研究） ，使用 PCR技术。另外上海农科院科研团队完成的“高比活植酸酶基因的获得及耐高温植酸酶的生产”项目，江南大学关于“一种耐高温、高比活植酸酶基因及其克隆和表达”项目等多项技术的问世，现在已经有多个品系的植酸酶基因被克隆测序完毕并在国际基因库中进行了注册，也可以直接购买得到。2、构建目的基因载体基因工程对载体的要求有：在宿主细胞中能保存下来并能大量复制；有多个限制酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个，如大肠杆菌 pBR322就有多种限制酶的单一识别位点，可适于多种限制酶切割的DNA 插入；含有复制起始位点，能够独立复制；分子量小，拷贝数；
5、有一定的标记基因，便于进行筛选；容易从宿主细胞中分离纯化，便于重组操作。一般来说，天然运载体往往不能满足上述要求，因此需要根据不同的目的和需要，对运载体进行人工改建。现在所使用的质粒载体几乎都是经过改建的。目前常用的载体主要有质粒载体、噬菌体载体和动物病毒载体。本实验中我们可以选择质粒载体。因为本实验是要在猪的唾液腺中表达，考虑到组织特异性表达的需要，所以用猪的内源性腮腺分泌蛋白的启动子成分与大肠杆菌 (E. coil)植酸酶基因构建在唾液腺中特异高效表达的重组体。之所以选择腮腺分泌蛋白是因为除了唾液淀粉酶外，人们发现唾液腺还大量分泌一种蛋白，其分泌量接近唾液淀粉酶的三倍，这种高丰度的蛋白就是
6、腮腺分泌蛋白 PSP(parotid secretory protein)，它是唾液中组织特异性高表达的一种蛋白, 研究证明猪的 PSP基因是组织特异性表达， 在腮腺中高表达， 在舌下腺和下颌下腺有少量表达，在其他组织不表达。中国农业大学尹海芳博士猪腮腺分泌蛋白基因的克隆及消除磷污染植酸酶基因小鼠模型的建立 的研究中已获得猪PSP基因 c DNA 含有一个完整的开放阅读框，编码 2 3 8 个氨基酸 (GenBank注册号为 AY205234)，并且通过 BAC （细菌人工染色体）文库筛选，获得含猪 PSP基因的阳性克隆， 测得猪 PSP基因的 8 个外显子和 7 个内含子及 PSP基因 10
7、kb 上游调控区。经过测序得到约 22kb的猪 PSP基因的基因组序列 (GenBank注册号为 AY197556)。同时利用辐射杂种克隆板(INRAMinnesota porcine radiation hybrid panel, IMpRH)对猪 PSP进行了染色体定位研究，将猪PSP基因定位在 17 号染色体长臂 q21-23 区域。我们可以利用猪PSP基因的上游调控区、信号肽、大肠杆菌植酸酶基因和猪PSP基因的下游调控区构建植酸酶转基因表达载体。具体构建载体的步骤如下：第一步：首先将猪PSP基因的上游调控区克隆，再通过长片段PCR扩增获得改造的上游调控区，然后将其连接到克隆载体上，便于
8、扩繁和下游连接的需要。第二步：大肠杆菌E.coli植酸酶基因 appA成熟蛋白部分的获得和改造，包括从大肠杆菌的基因组中扩增出植酸酶基因和基因片段两端酶切位点添加及内部酶切位点改造。同时将所需的猪 PSP基因的信号肽部分进行人工合成。 克隆到 Pmd-T18载体 （pMD 18-T Vector是由 pUC18载体改建而成的。在pUC18 载体的多克隆位点处的Xba I 和 Sal I 识别位点之间插入了 EcoR V 识别位点，用 EcoR V 进行酶切反应后， 再在两侧的 3 端添加“ T”而成。）上，然后将信号肽和植酸酶基因连接在一起，构建成含猪PSP基因信号肽和大肠杆菌植酸酶基因的载体
9、。 第三步：下游调控区的克隆改造及与猪PSP基因上游调控区的连接。包含猪下游调控区的 PCR 、克隆及与猪 PSP基因上游调控区的连接。最后一步：将信号肽、植酸酶基因、猪PSP上游调控区和下游调控区最终构建为在唾液腺特异表达的植酸酶转基因表达载体。在此过程中要注意到植酸酶基因是来源于原核生物大肠杆菌基因组和猪是真核生物这一差别。3、实施转基因目前转基因的方法有很多，比如显微注射法、反转录病毒载体、精子介导、体细胞克隆等，针对本实验可用的方法有几个，在此主要介绍显微注射法。（1）显微注射法： 植酸酶基因表达载体构建完成后生产用于注射的DNA 溶液 猪受精卵的获得。一般均采用激素注射的方法，对母猪
10、进行超数排卵的处理，目前比较成熟的方法是使用 PMSG（孕马血清促性腺）和 HCG （人绒毛膜促性腺激素）的协同作用，诱导母猪发生超数排卵。 原核显现一般动物都容易看到原核，但猪的受精卵含有丰富的卵黄颗粒，不易看到原核，所以要用一种特殊的技术使原核显现出来，目前最常用的是对猪的受精卵进行离心处理。经过离心处理后，在显微镜下猪胚胎细胞质明显地分为三层：不透明层；半透明层；透明层。原核一般都处在半透明层和清亮层之间 受精卵显微注射将 DNA溶液注入一个或两个原核中，看到原核略显膨胀，立即将玻璃针撤出，完成注射。 将显微注射的猪原核胚立即移植到同期化的受体母猪的输卵管内，一般两侧输卵管各移植胚胎 1
11、520 枚。 对出生的幼畜进行基因整合和表达的检测，把筛选出来的转基因动物繁殖传代培养，进而建立转基因动物的家系和群体，比如猪可以用耳朵来做相应的实验。（2）反转录病毒载体法【简略说明】反转录病毒载体可以容纳外源DNA的长度在 10 kb 左右，以很高的转染率感染宿主细胞，特别是分裂中的细胞。而植酸酶的基因在2KB以内，所以用反转录病毒载体携带植酸酶基因使其转染到宿主细胞内是可行的。载体用反转录病毒载体慢病毒载体，慢病毒(lentivirus, LV)是逆转录病毒科的病毒成员。病毒感染细胞后，在自身逆转录酶的作用下以病毒基因组RNA为模板，逆转录形成双链 DNA 中间体，即原病毒 (provi
12、rus)或前病毒 DNA ，然后整合到宿主细胞染色体DNA上。作为细胞基因组的一部分，随着细胞基因组的复制和细胞分裂传递下去，并且在宿主RNA 聚合酶的作用下，原病毒转录形成新的子代病毒。慢病毒基因组结构复杂，除了含有gag、pol 、env 等 3 个逆转录病毒共同具备的结 构基因以及 5 端和 3 端 LTR结构外，还包括 4 个辅助基因 vif 、vpr 、nef 、vpu 和 2 个调节基因 tat 和 rev 。 建 HIV-1 载体系统基本原理HIV-1 载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。包装成分由HIV-1 基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反
13、式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV 顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽量减少二者的同源性。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和 Pol 蛋白，另一个质粒表达Env 蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。在此要注意构建目的基因的组织特异性启动子。所获重组病毒超速离心至滴度为1 106IU/ l 。将病毒液(10100 pl) 进行受精卵卵周隙注射。注射后胚胎移植到假孕母猪体内。4、转基因的鉴定通过显微注射获得了植酸酶转基
14、因猪，筛选出阳性猪，进行唾液中植酸酶活性检测、粪便植酸磷的检测 .（1）分子水平检测目前, 转 基因动 物的 鉴定 技术主 要包 括以下 两个 方面 : 一是 以分 子杂 交为基 础的Southern 杂交和斑点杂交。二是以PCR 技术为基础发展起来的各种鉴定方法。到目前为止， Southern 杂交仍是工人的最可靠的分子检测方法。Southern 杂交的方法是 : 可以取猪耳朵组织或血液，提取DNA ，设计适当的引物，进行PCR 扩增电泳，将 PCR 阳性产物转移到尼龙膜上，以同位素标记的外源基因片断作为杂交探针，对 PCR 阳性产物进一步确认。进行 Southern 杂交时，底物中应包括未
15、曾酵解的大分子DNA和至少两种限制性内切核酸酶消化的 DNA 样本，只有三种样本都给出合理的结果，才能确定植酸酶基因确实已经整合到基因组中。与 Southern 杂交技术相比 , 斑点杂交操作较为简单 , 只须将转基因猪的基因组DNA 点在载体膜上，与探针杂交后，即可通过显影获得结果。但这种方法在转基因动物筛选时却常常由于这一技术本身存在的技术问题，如动物内源性基因与外源基因有同源性而导致检测结果假阳性，制备的基因组 DNA 过于粘稠及整合基因拷贝数低等原因造成的杂交结果不可靠，难于判断，现在很少有报道以此进行转基因动物的鉴定。其实，转基因动物内源性基因与外源基因没有同源性时，利用斑点杂交方法
16、对转基因动物进行大规模的初筛是可行的。PCR 技术的运用使繁重的转基因动物鉴定工作大大简化了，我们只需根据外源基因设计特异的检测引物， 对转基因动物的基因组DNA 进行 PCR 扩增 , 通过 PCR 产物的大小就可以初步确定靶基因。 使用好 PCR扩增技术的关键是设计好引物，引物应当是特异的， 只能从转基因动物扩增出 DNA 片段，不能从阴性的非转基因材料中扩增出DNA 。本实验中可以利用所表达的植酸酶结构基因和猪PSP基因上游调控区的序列设计两对 引物，扩增片段长度分别为1.2kb 和 1kb，利用这两对引物对转基因猪后代进行检测。要注意的是斑点杂交和PCR 检测出来的阳性样本，都要用Southern 杂交等其他方法进一步确证才行。（2）营养学方法检测对于 G0代转基因猪， 可以检测其唾液中植酸酶的含量，在利用 G0代繁殖出 G1代的转基因猪，检测唾液中植酸酶活性，并与非转基因猪比较。用含有 53植酸磷的大豆作为唯一的磷源配制日粮，饲喂具有中等唾液植酸酶含量（2420U/ml）的 G
