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1、地高辛标记探针检测重组人干扰素地高辛标记探针检测重组人干扰素 2b2b 中中 DNADNA 残留量的研究残留量的研究(1)(1)【摘要】 摘要:目的建立检测注射用重组人干扰素 2b 半成品中外源性 DNA 残留量的方法。方法以重组人干扰素 2b 工程菌基因组 DNA 为模板,用地高辛标记探针,以此探针杂交并进行显色反应。结果半成品中每人份剂量的外源性 DNA 残留量均小于 10ng。结论该方法检测特异性较强,操作较安全简便,可用于重组人干扰素 2b 制备过程中的质量监控及半成品的检定。【关键词】 地高辛 DNA 残留量重组人干扰素 2b注射用重组人干扰素 2b 是利用携带人白细胞干扰素2b 基
2、因质粒的重组大肠杆菌生产所得，具有广谱抗病毒、抑制细胞增殖以及提高免疫功能等作用。主要用于治疗一些病毒性疾病，如急慢性病毒性肝炎、带状疱疹、尖锐湿疣等。由于在生产过程中使用了工程菌大肠杆菌,而宿主菌的残留 DNA 是重组药物中特有的潜在致癌性杂质,因此对干扰素 2b 半成品中外源性 DNA 残留量的检测极为重要1，2 。本文使用地高辛标记探针杂交法检测注射用重组人干扰素 2b 半成品中的外源性 DNA 残留量，操作较安全简便,可用于重组人干扰素 2b 制备过程中的质量监控，从而保证了其安全性,符合相关质控标准3 。1 材料与方法11 材料与试剂重组人干扰素 2b 工程菌的宿主菌（北京生研所）和
3、重组人干扰素 2b 半成品；地高辛标记和检测试剂盒（Roche） ；正电荷尼龙膜（Millipore） ；细菌基因组 DNA提取试剂盒（DPXX,北京百泰克生物技术有限公司） ；蛋白酶 K（Amresco） ；鲱鱼精 DNA（Sigma） ；其余试剂均为分析纯。工程菌基因组 DNA 的制备大肠杆菌的基因组 DNA 通过百泰克细菌基因组 DNA 提取试剂盒制备,并通过 1%琼脂糖凝胶电泳法和分光光度法测定提取的 DNA 纯度和浓度,并将提取的 DNA 于-20冻存备用。探针的制备取 1g 基因组 DNA,加入无菌双蒸水至终体积 15L,沸水浴 10min 后,迅速转入冰浴中冷却。取Hexanuc
4、leotidemixture2L 和 dNTPlabelingmixture2L加入变性 DNA 中,并加入 Klenowenzyme1L 混匀，于 37孵育过夜。加入 0.2mol/LEDTA 缓冲液 2L、3mol/L 醋酸钠溶液 L 和无水乙醇 75L，置20冰箱中 2h 以上。15000r/min 离心 10min，弃去上清，沉淀用 TE 缓冲液复溶即得探针溶液。14 探针标记效率的检测取 DIGLabeledControlDNA 都稀释成 1ng/L,分别依次稀释至 10、5、1、 、 、 、 pg/L,同时取标记好的探针，按上述方法依次稀释，然后分别取各浓度点样 10L 于尼龙膜上
5、,经固定和封闭后,通过 AP 缓冲液和 NBT/BCIP 进行显色反应,比较两者显色深浅从而确定标记探针的浓度。样品的处理取 2 批重组人干扰素 2b 半成品,用 DNA 稀释缓冲液将样品稀释至含每 100L 含 1/10 人份剂量备用。16 外源性 DNA 残留量的检测将 2 批半成品、阳性对照（基因组 DNA） 、阴性对照（DNA 稀释液）和空白（TE 缓冲液）经蛋白酶 K 预处理后4 ，沸水浴 10min，立即冰浴冷却，8000r/min 离心 5s，点膜、固定、68杂交过夜，之后用 AP 缓冲液和 NBT/BCIP进行显色反应，与阳性对照比较，根据显色深浅判定半成品中外源性 DNA 的
6、含量。重现性试验按上述检测方法，对 2 批重组人干扰素 2b 半成品重复测定 3 次，比较 3 次的结果，考察该检测方法的重现性。2 结果21 工程菌基因组 DNA取部分基因组 DNA 电泳,结果见图 1。结果表明制备的基因组 DNA 完整性较好,A260/A280 比值为,纯度符合要求。maker;bacteriagenomeDNA图 1 工程菌基因组 DNA 电泳图（略）Figure1 ElectrophoresisofengineeringbacteriagenomeDNA22 探针标记效率的检测探针标记效率的检测结果见图 2。从图中可见，标记探针 pg 稀释点可见显色,表明标记探针达到预期的标记效率,而且效率较高,经比较两者显色深浅,表明标记达到要求的量,确定探针浓度为 100ng/L,总量为 2000ng。（作者：未知本文来源于爬虫自动抓取，如有侵犯权益请联系 service立即删除）
