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1、第十章 微生物学新技术在环境领域中的应用,第一节 固定化技术一、固定化酶和固定化微生物的定义和特点固定化酶，通过物理吸附法或化学键合法将水溶性酶和固态的不溶性载体相结合，使酶变成不溶于水但仍保留催化活性的衍生物。特点：1、固定化酶比水溶酶稳定。2、固定化酶适合连续化、自动化和管道化工艺，还可回收、再生和重复使用。3、固定化酶可以设计成酶布和酶柱等形式。,固定化微生物，用制备固定化酶的方法将微生物固定在载体上，即成固定化微生物。固定化细胞比游离细胞稳定性高，催化效率比离体酶高，且比固定化酶操作简便，能完成多步酶反应。,二、酶的分离提纯利用微生物生产酶制品可以分为菌种选育、发酵培养、分离提取和酶制
2、品保存四个步骤。1纯化：盐析法，绝大多数情况采用（NH4）2SO4。 有机溶剂沉淀法， 乙醇或丙酮层析法，吸附层析法、离子交换层析法、分子筛过滤层析法、等电点沉淀法,三、固定化方法固定化方法有载体结合法、交联法、包埋法和逆胶束酶反应系统。,1、载体结合法将酶固定在非水溶性载体上。载体有葡聚糖、活性碳、胶原、琼脂糖、多孔玻璃珠、高岭土、硅胶、氧化铝、羧甲基纤维素等。2、交联法利用双功能试剂或多功能试剂使酶与酶发生交联而进行固定。交联剂有：戊二醛、双重氮联苯胺和六甲撑二异氰酸酯。,3、包埋法将酶包埋在凝胶格子（格子型）中，或由半透性的聚合物膜组成的胶囊内（微胶囊型）的方法。 格子型的包埋材料：聚丙
3、烯酰胺（PACAM）凝胶、聚乙烯醇（PVA）、琼脂、硅胶等。微胶囊型的包埋材料：尼龙、乙基纤维素和硝酸纤维素,4、逆胶束酶反应系统表面活性剂的两性分子在有机溶剂中自发形成聚集体，其亲水一端连接成逆胶束的极性核，水分子插于核中，其疏水性的一端进入主体有机溶剂中，酶分子溶于逆胶束中，组成逆胶束酶系统。对微生物细胞的固定化最适合用凝胶包埋法。,四、固定化酶和固定化微生物在环境工程中的应用英国采用固定化细胞反应设备处理含氰废水。中国应用固定化细胞技术降解含直链烷基苯磺酸钠（LAS）废水，去除率和酶活性保存率均在90%以上。德国将9种降解对硫磷农药的酶共价固定在多孔玻璃珠、硅胶珠上，制成酶柱处理对硫磷废
4、水，获得95%以上的去除效果。,第二节 微生物絮凝剂,传统的絮凝剂有无机和有机高分子两类，第三类为微生物絮凝剂。加量为200mg/L一、微生物絮凝剂的特点 1、来源广泛，生产周期短且效率高。2、具很高的絮凝效果，与聚铁、聚丙烯酰胺等絮凝剂比，絮凝速度大，沉淀易过滤。3、对人体和动物无危害。4、具可生化性，可防止絮凝后对环境造成的二次污染。5、能广泛应用于各种污水的处理。,二、微生物絮凝剂的结构组成、化学本质1、微生物絮凝剂的结构组成具有絮凝性的微生物涉及各类微生物，有细菌、放线菌、霉菌、酵母菌，原生动物等（表11-1）。微生物絮凝剂的组成和结构见表11-2。,2、微生物絮凝剂的化学本质微生物所
5、产生的絮凝剂主要是微生物代 谢过程中所产生的多聚糖类，有些是蛋白质（或多肽），或者是含有蛋白质（或多肽）。,三、微生物絮凝剂的絮凝机理“桥联作用”机理：絮凝剂大分子借助离子键、氢键和范德华力，同时吸附多个胶体颗粒，在颗粒之间产生“架桥”，从而形成一种网状的三维结构而沉淀下来。絮凝剂的分子结构、形状、相对分子质量和所带基团会影响其絮凝效果。,四、微生物絮凝剂的合成和应用1、微生物絮凝剂的合成一般认为，微生物多在其生长的中后期释放絮凝剂形成絮体，但到了静止期后期，细胞不再产生新的絮凝物质，甚至会由于出现解絮凝酶而导致絮凝活性下降。培养基的组成、初始pH、培养温度、通气状况等会影响絮凝剂的合成。提取
6、方法：凝胶色谱，有机溶剂提取和碱提取。,2、微生物絮凝剂的应用 (1)高浓度有机水废水的处理NOC-1生物絮凝剂加Ca2+处理畜业生产产生的废水； C-62菌株产生的絮凝剂处理？革废水。 （2）染料废水的脱色用于造纸黑液、糖蜜废水、墨水废水的脱色。,(3)乳化液油水分离用广泛产碱菌（Alcaligenens latus ）培养物易将棕榈酸从其乳化液中分离出来。 （4）活性污泥的处理从红平红球菌 （Rhodococcus erythropolis ）分离得到的絮凝剂可促进污泥的沉降。,第三节 分子生物技术在环境领域中的应用,一、核酸探针和PCR技术1、核酸探针在适当条件下，单链DNA片段能与另一
7、段与之互补的单链片段结合，这个过程称为核酸杂交。利用这一特性，将最初的DNA片段进行标记，即可做成核酸探针。 利用核酸探针技术可以检测环境中是否存在某些特定种类的微生物，如致病菌和病毒。,2、PCR技术PCR(Polymerase chain reaction)称为DNA多聚酶链式反应，是对特异性DNA片段在体外进行扩增的一种非常快速而简便的方法。 （1）PCR的原理：,（2） PCR技术的操作方法：加热变性 将待扩增的DNA置于9495的高温中加热5min，使双链DNA解链为单链DNA，分开的两条单链DNA作为扩增的模板。退火 将加热变性的单链DNA溶液的温度缓慢下降至55 后，在这过程中引
8、物的DNA的碱基将与单链模板DNA一端碱基配对。,延伸 退火之后，当温度上升至72时，在耐热性Taq DNA多聚酶、适当的PH和一定的离子强度下，寡核苷酸引物（引物DNA）碱基延伸和模板DNA结合构成双链DNA。经过2530次循环，扩增倍数达106，可将2kb 的DNA由原来的1pg扩增到0.5 1g。,（3）PCR技术的应用 应用PCR技术研究特定环境中微生物区系的组成、结构，分析种群动态。 应用PCR技术监测环境中特定的微生物。 量化环境系统中微生物群体的各组成成员。,二、16S rDNA序列及其同源性的分析 通过对16S rRNA基因的DNA序列分析，可以分析细菌的种类信息，并且已经逐渐
9、成为微生物分类和鉴定中非常重要而且有用的指标和手段。,16s rRNA基因技术在环境科学领域中的应用鉴定生物降解菌；研究某一特定环境中微生物的区系组成，进而了解其种群动态，研究微生物的多样性。PCR-DGGE或PCR-TGGE分析微生物的多样性,变性梯度凝胶电泳DGGE,1979年由Fisher和Lerman最先提出的用于检测DNA片段中的点突变的一种电泳技术。Muyzer 等人在1993 年首次将其应用于微生物群落结构研究 。后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳（Temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）。,原理,双链DNA 分子在一般的
10、聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。不同长度的DNA 片段能够被区分开，但同样长度的DNA 片段在胶中的迁移行为一样，不能被区分。,DGGE/TGGE 技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度或是温度梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA 片段区分开来。,一个特定的DNA 片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域(melting domain, MD)和解链行为(melting behavior) 。,一个几百个碱基对的DNA 片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基对组成。当变性剂浓度逐渐增加各区域依次发生解链。,显示的
11、是一个234bp 长的DNA 片段的解链区域，横坐标是该DNA 片段的序列，依次从第一个碱基到第234 个碱基；纵坐标是解链温度。该DNA 片段共有3 个解链区域。 MD1 是解链温度最低的一个解链区域，MD3 是温度最高的一个解链区域。,不同的双链DNA 片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域及各解链区域的解链温度也是不一样的。,当它们进行DGGE时，一开始变性剂浓度比较小，不能使双链DNA 片段最低的解链区域解链，此时DNA 片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样。,一旦DNA 片段迁移到一定位置，其变性剂浓度使双链DNA 片段最低的解链区域解链，部分解链的DNA 片段在胶中的迁移
12、速率会急剧降低。因此，不同的DNA 片段会在胶中的不同位置处发生部分解链导致迁移速率大大下降，从而在胶中被区分开来。,然而，当变性剂浓度达到DNA 片段最高的解链区域温度时，DNA 片段会完全解链，此时它们又能在胶中继续迁移，这些片段就不能被区分开来。,在DNA 片段的一端加入一段富含GC 的DNA 片段（GC 夹子，一般30-50 个碱基对）可以解决这个问题。,含有GC 夹子的DNA 片段解链温度很高，可以防止DNA 片段在DGGE 胶中完全解链。,当加了GC 夹子后，DNA 片段中每个碱基处的序列差异都能被区分开。,当用DGGE/TGGE 技术来研究微生物群落结构时，要结合PCR（poly
13、merase chain reaction）扩增技术，用PCR 扩增的16S rDNA 产物来反映微生物群落结构组成。,通常根据16S rRNA 基因中比较保守的碱基序列设计通用引物，其中一个引物的5-端含有一段GC 夹子，用来扩增微生物群落基因组总DNA，扩增产物用于DGGE/TGGE 分析。,由于DGGE/TGGE一般只能分析500 bp 以下的DNA片断，所以一般选择扩增16S rRNA基因的V3区或V6-V8区。,16S rDNA的高可变区,E. coli 16S rRNA二级结构及各可变区,V3区 约170bpV6-V8区 约350bp片段大小不同，携带的信息量不同，选择不同的区域得
14、到DGGE图谱不同，群落信息也有差异不同的片段大小对应的胶浓度也不同 根据需要选择最合适的,提取基因组后，扩增16SrDNA高可变区片段,确定合适的变性剂范围,对DNA片段进行有效分离,根据变性剂梯度方向与电泳方向相同或不同,DGGE分为：垂直DGGE 平行DGGE,常规的DGGE电泳技术对于长度超过500bp的DNA片段的序列变化情况,只能有50%的检出率。应用“GC夹板”技术可使检出率提高到100 %。,当等长的双链DNA分子在含梯度变性剂(尿素、甲酰胺)聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时,因其解链的速度和程度与其序列密切相关; 部分解链的DNA分子的迁移速度随解链程度增大而减小。,DGGE的参数
15、：,胶浓度 取决于片段大小 ，通常不宜超过500bp6%胶浓度： 400 1000bp8%胶浓度： 200 400bp10%胶浓度：100 300bp 变性剂范围 不同的样品不同温度 一般都用60摄氏度电压时间,环境样品分析的流程,DGGE在微生物分子生态学中的应用,对微生物群落结构进行对比、分析或者跟踪监测。通过扩增功能基因来研究功能基因及功能菌群的多样性。跟踪及检测细菌的富集和分离，评价不同的培养条件对分离菌种的影响。,举例：,油藏古细菌 V3区 DGGE 图谱胶浓度：10% 变性剂范围：40%-60% 电压：200V 运行时间：4.5h,优点： 重现性强，可靠性高，方便快捷而且使用成本低
16、。 能同时分析多个样品，使其非常适于分析环境样品 中微生物群落结构的变化。缺点：分辨率有限，复杂环境中（土壤或肠道），只能检测出优势菌。一般只能分析500bp以下的片段。PCR过程产生的异源双链和单链DNA会对分析造成偏差。,三、生物芯片 通过微加工技术和微电子技术将生物探针分子（寡聚核苷酸、cDNA、基因组DNA、多肽、抗原、抗体等）固定在硅片、玻璃片、塑料片、凝胶、尼龙膜等固相介质表面，从而构建出一个微型生物化学分析系统。生物芯片可以对细胞、蛋白质、DNA以及其他生物组分进行准确、快速和大信息量的检测。,生物芯片技术可广泛应用于疾病诊断和治疗、基因组图谱、药物筛选、农作物选育、司法鉴定、食品卫生监督等多个领域。在环境检测领域，可以利用生物芯片技术快速检测微生物或有机化合物对环境、人体、动植物的污染和危害。,
