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1、纤维素酶活力的测定,二O一一年三月,指导教师：孙运军 研究生：唐志强 胡展,一、目的和内容目的：了解纤维素酶的种类和测定原理，掌握其活力的测定方法。内容：测定并计算纤维素酶的活力。,二、基本原理1. 纤维素酶是一类分解纤维素的复合酶，目前公认的有四种:（1）内切-1,4-葡聚糖酶；（2）外切-1,4-葡聚糖酶；（3）纤维二糖水解酶；（4）纤维二糖酶（-葡聚糖苷酶）。,纤维素酶液中各种酶的作用方式图,2. 纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成红棕色的氨基化合物，在540nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色
2、强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。 由不同底物测得的酶活力分别称作FPA (滤纸糖酶活力) 和CMCA (羧甲基纤维素酶活力)。,DNS与还原糖的反应,DNS试剂,50,30min,沸水浴5min,为了统一标准，目前通常以羧甲基纤维素钠盐（简称CMCNa）作为纤维素酶作用的底物。但需要指出的是CMCNa无论在结构上（见图）还是在性质上都不同于天然纤维素，天然纤维素不溶于水，而CMCNa有很强的亲水性，非常容易被纤维素酶分解。在相同条件下，同一种纤维素酶分解CMCNa所产生的还原糖远大于水解天然纤维素所产生的还原糖。 纤维素酶水解羧甲基纤维素钠（CMCNa,C
3、6H9O5 (CH2COONa)n）释放的羧甲基还原糖，与碱性条件下的DNS试剂发生反应，生成红棕色的氨基化合物，该化合物在540nm下有最大光吸收，由此，可根据测得的吸光值与葡萄糖浓度的关系来计算纤维素酶的活力（CMCA）。,羧甲基纤维素钠的结构,1.器材：水浴锅、分光光度计、记时器、 比色管（4支+6支）、移液管（5支）、吸耳球2.试剂（公用）： 蒸馏水 DNS试剂1416ml蒸馏水，10.6g 3,5-二硝基水杨酸和16g NaOH混合并溶解，加酒石酸钾钠306g，苯酚（加热溶解）7.6ml，亚硫酸钠8.3g。 2%羧甲基纤维素纳水溶液（CMCNa） 纤维素酶液（酶液A、酶液B）A：15
4、mg/ml纤维素酶水溶液用0.05M（pH=4.5）柠檬酸缓冲液稀释10倍。B：15mg/ml纤维素酶水溶液用0.05M（pH=4.5）柠檬酸缓冲液稀释20倍。 1mg/ml标准葡萄糖溶液,三、器材和试剂,四、操作步骤,1. 标准曲线的制定取6支25ml比色管，按表1分别吸取标准葡萄糖溶液和DNS试剂，沸水浴5min，冷却，然后加蒸馏水定容至25ml，用蒸馏水调零，于540nm处测光密度值。以葡萄糖的含量为横坐标，以OD540nm 为纵坐标，绘制标准曲线。,表1 葡萄糖标准曲线的制定,2. 酶活力的测定：(1)测定：取两支25ml比色管，作好标记（A和B），分别加入酶液A和酶液B各0.5ml，
5、再加入已经预热的2%羧甲基纤维素纳（CMCNa）0.5ml ，混匀，50保温30min，然后加入3ml DNS试剂，于沸水中水浴5min（显色），冷却，加入蒸馏水定容到25ml，摇匀后，在540nm处测定光密度值OD540nm。(2)对照：取两支25ml比色管，作好标记（A和B），分别加入酶液A和酶液B各0.5ml，沸水浴中放置510 min，然后加入底物（2% CMCNa）0.5ml 、DNS试剂3ml，并煮沸5min，冷却，加入蒸馏水定容到25ml，摇匀后，在540nm处测定光密度值OD540nm。,3.酶活力的计算以国际单位（IU）为标准，在上述条件下，纤维素酶每分钟催化羧甲基纤维素纳水
6、解生成1mol葡萄糖的酶量定义为一个活力单位。 1ml纤维素酶溶液的活力单位数：CMCA= KOD540nmN /（0.180.530）K 常数，由标准曲线得出，数值上等于OD为1 时所相当的葡萄糖的毫克数（mg）； OD540nm样品测定与空白实验的吸光值之差；N酶液的稀释倍数；(酶液A的N值为10，酶液B的N值为20)0.5反应酶液的体积；30反应时间；0.181mol葡萄糖的毫克数。,五、实验报告一、纤维素酶的活力测定1. 绘制标准曲线。2. 计算1mg纤维素酶的活力。 二、 问题和思考1. CMCA测定的原理。2. 复合酶和多酶复合体的区别。,清 场,各组将实验台清理好，实验用具清洗干净，恢复实验开始时的状态。 派人清扫实验室。,
