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1、两种去除血清高丰度蛋白方法的比较研究比较乙腈沉淀法和MERCK 公司的血清白蛋白和IgG 去除试剂盒去除人血清中高丰度蛋白的效果。方法应用乙腈沉淀法和MERCK 公司的血清白蛋白和IgG 去除试剂盒对血清样品进行处理，Tricine-SDS-PAGE 电泳和 SELDI-TOF-MS检测去除高丰度蛋白的效果。结果 乙腈沉淀法能在去除血清高中丰度蛋白的同时收获更多的10kD 以下的小分子量蛋白，MERCK公司的试剂盒也能有效地去除血清高中丰度蛋白，特异性较好。结论两种方法均能去除血清中高丰度蛋白，需根据研究目的选择适合的方法。血清中小分子量蛋白（10kD ）认为是一些激素、细胞因子、生长因子以及
2、一些大分子蛋白水解的片段并且在生物学过程中扮演着关键的角色1, 2，并可能作为疾病的标志物。对肝癌患者血清的检测中，分子量210 kD 的小分子量蛋白，有许多蛋白在肝癌患者血清中高表达，这些蛋白很可能是新的肝癌相关的血清蛋白标志物3 。对这些差异蛋白分子进行鉴定，将有助于探讨肝癌的发生机制，并为设计治疗靶点提供依据，对蛋白质数据库的进一步完善具有重要意义。从复杂的血清样品中鉴定出标志蛋白，首先要考虑的问题是血清中蛋白质种类很多，其中有许多丰度较高但没有特殊生物学信息的蛋白质，对目前的蛋白质分离鉴定技术提出了巨大挑战。因此高丰度蛋白的去除和低丰度蛋白的富集己成为血清样品处理中的首要步骤，本研究主
3、要对乙腈沉淀法和Merck 公司的去除Albumin/IgG 试剂盒法去除血清中高丰度蛋白和富集小分子蛋白的效果进行比较研究。1 材料与方法1.1 实验样品肝癌患者血清： 来自广西医科大学附属肿瘤医院住院患者，临床诊断为原发性肝癌患者。1 2主要试剂与仪器乙腈 (ACN) ， 美国 Sigma 公司；ProteoExtract ? Albumin/IgG Removal Kit , 德国 MERK 公司；丙烯酰铵、N , N - 甲叉双丙烯酰铵、三羟甲基氨基甲烷( Tris) 、三羟甲基甲基甘氨酸( Tricine) 、十二烷基硫酸钠( SDS) 、尿素 ,AMERSO 公司 ;低分子量蛋白质
4、标准品 ,上海生工生物工程有限责任公司; 垂直电泳槽， Bio-Rad 公司；蛋白芯片生物系统（ PBS II C ）及 CM10 芯片购自美国Ciphergen 公司。13 方法131 乙腈沉淀法去除血清中的大蛋白将 60 l 血清加入到120 l 的乙腈中， 剧烈振荡5s，放置室温30min，样品在室温下14,000g 离心 10 分钟，将上述组分用冻干机浓缩到60 l 。1.3.2 ProteoExtract? 白蛋白 /IgG 去除试剂盒去除血清中的白蛋白/IgG, 按试剂盒的说明书进行操作。(1)样品的准备 : 将 60 l 血清用 10 倍的结合缓冲液（600 l）稀释于分离管中。
5、(2)柱子的预处理 :将蓝色的盖子从柱子上拿开，倒置在纸巾上去除贮存缓冲液；拿开底部的接头后，将柱子放入合适的缓冲液收集管；加入0.85ml 的结合缓冲液让其通过重力作用流过树脂床。丢弃缓冲液收集管；将柱子放入新的样品收集管。(3)白蛋白 /IgG 的去除：将稀释的样品加入柱子并让其通过重力作用流过树脂床。收集流动 相，再用 600 l 的结合缓冲液清洗柱子。让其通过重力作用流过树脂床。收集洗脱液；重复用 600 l 的结合缓冲液清洗柱子。其通过重力作用流过树脂床。收集洗脱液。这些结合的组分内含有去除白蛋白/IgG 的样品。将上述组分用冻干机浓缩到60 l， 进行 Tricine-SDS-PA
6、GE电泳分离蛋白和WCX2 芯片检测。1.3.3 将收集的两种样品进行Tricine-SDS-PAGE 电泳分离蛋白和WCX2 芯片检测。2 结果2.1 Tricine - SDS - PAGE 电泳检测结果经去除血清白蛋白ProteoExtract? 白蛋白 /IgG 去除试剂盒和乙腈沉淀法去除高丰度蛋白后的样品经Tricine - SDS - PAGE电泳分离后，凝胶结果（图 1）显示，两种方法均能将血清中的一些大分子量和高丰度的蛋白去除，与原血清相比， 白蛋白的含量已经明显减少，而且在用乙腈沉淀法处理的样品中，在 6.5kD 以下还出现一条的小分子量蛋白条带。M：低分子量蛋白质标准品A：
7、乙腈沉淀法处理后的肝癌患者血清B：肝癌患者原血清C：白蛋白 /IgG 去除试剂盒处理后肝癌患者血清图 1 两种去除高丰度蛋白方法的比较电泳图2.2 SELDI-TOF-MS检测结果经 ProteoExtract? 白蛋白 /IgG 去除试剂盒和乙腈沉淀法去除高丰度蛋白后的样品经SELDI-TOF-MS检测，如图2 所示，与原血清相比较，经去除血清白蛋白 ProteoExtract? 白蛋白 /IgG 去除试剂盒去除高丰度蛋白后，在10 kD 以下仍保存了大部分的小分子量蛋白，并且在8kD 左右的蛋白峰明显比原血清的表达量要高，这提示白蛋白 /IgG 去除试剂盒能减低白蛋白和IgG 对小分子低丰
8、度蛋白的掩盖，从而增加8kD 左右的蛋白峰的相对表达丰度；而乙腈沉淀法同样也能去减低高丰度蛋白对小分子低丰度蛋白的掩盖，并且能发现更多小分子量蛋白和肽峰，经乙腈沉淀后，与原血清相比，6kD 以下出现了 SELDI-TOF-MS检测原血清时检测不到的小分子量蛋白和肽峰，这与Tricine - SDS - PAGE 电泳检测结果相符合，但在8kD 左右的小分子量蛋白和肽峰则消失（图2） 。1：肝癌患者原血清2：白蛋白 /IgG 去除试剂盒处理后肝癌患者血清3：乙腈沉淀法处理后的肝癌患者血清3 讨论血清中的20 余种高丰度蛋白占血清总蛋白的99%以上，如：白蛋白、免疫球蛋白、转铁蛋白、补体C3 等，
9、所以其余的上千种其中可能与疾病诊断密切相关的小分子蛋白含量甚微46 。近年来质谱鉴定蛋白的技术得到飞速发展，但是要得到比较准确的结果要求样品要有一定的纯度和浓度， 而众多高中丰度蛋白的存在必然严重干扰小分子蛋白质的分离检测和鉴定7 。因此在进行蛋白组学研究中，有必要对血清样本进行特殊的预处理，先去除血清中的高分子量、高丰度的蛋白， 排除它们对低丰度蛋白质的掩盖作用，提高灵敏度， 有助于更好地鉴定其他蛋白， 促进低丰度蛋白质的检出。目前常用的技术有蛋白质沉淀法、亲和技术、 色谱技术等。目前常用的技术有蛋白质沉淀法、亲和技术、色谱技术等。蛋白质沉淀法是一种快速的杂质蛋白质去除方法，常用的蛋白质沉淀
10、剂有乙腈、乙醇等。 通常在沉淀蛋白质后离心，上清层可经挥干、 重溶或不作处理直接进行分离分析。Tirumalai RS等6 向 10mL 血清样品加入20%ACN ，使小分子量蛋白及多肽在变形条件下与高丰度蛋白充分解离， 通过离心超滤法有效去除了高分子量的高丰度蛋白，富集了血清中的小分子量蛋白、多肽成分及来自大蛋白的肽片段。研究中发现在用乙腈深沉法去除大分子蛋白后，与原血清比较，在Tricine - SDS - PAGE电泳图中和蛋白芯片图谱中，均出现在4kD 左右的低丰度蛋白，说明乙腈沉淀法可以初步去除大分子蛋白对低丰度蛋白分离的影响。但在蛋白芯片图谱中，发现血清经乙腈沉淀后，有部分的小分子
11、量蛋白表达降低或消失，这提示在血清蛋白质学研究策略中，去除高丰度蛋白质的同时，要注意考察可能损失的许多有价值的生物标志物信息。亲和技术是利用蛋白质和其配体或抗体间的相互作用来特异结合白蛋白、IgG 等高丰度靶蛋白，从而富集血清中剩余的低丰度蛋白。目前， 已经有多种商业化的去除血清白蛋白和免疫球蛋白IgG 等高丰度蛋白的试剂盒，这些试剂盒，操作简单、方便，且一次性使用，减少了样品的交叉污染。 本实验采用MERCK 公司的 ProteoExtractTM高丰度蛋白去除试剂盒后，与原血相比， 血清样品中小分子量低丰度蛋白质得到较好的分离和浓缩，Tricine-SDS-PAGE电泳图和SELDI-TO
12、F-MS蛋白质图谱中10kD 以下的蛋白质峰在去除高丰度蛋白后仍存在。在蛋白质图谱中可以看到部分小分子量蛋白的丰度比原血清要高，说明应用该方法确实达到了富集人血清中小分子低丰度蛋白的目的，而且与原血清的蛋白图谱比较，经此试剂盒处理后的血清浓缩到合适浓度，电泳结果能很好地显示与原血清全部电泳条带的分布。Bjorhall K等8 比较了 5种商业化的去除血清高丰度蛋白的试剂盒后，发现默克公司的ProteoExtractTM Albumin/IgG removal kit在清除的效率、特异性和重复性等各方面的效果是最好的。但究中也发现浓缩后， 电泳图中白蛋白条带浓度仍比较高，这可能会对小分子量蛋白的电泳分离以及后续的质谱鉴定造成一定的影响。综合比较以上两种去除高丰度蛋白的方法，可以看出这两种方法均能有效地去除血清中的高丰度蛋白。乙腈深沉法去除高丰度蛋白的效率比较高，达到富集小分子量低丰度蛋白的目的，但也会造成部分小分子量蛋白的损失。ProteoExtractTM Albumin/IgG removal kit由于其对血清中其他蛋白的非特异性吸附很少，能更好地保存原血清中小分子量蛋白的分布信息，但浓缩后电泳图中白蛋白条带浓度仍比较高。因此在进行血清小分子量低丰度蛋白进行研究时，要根据不同的研究目的选择去除高丰度蛋白的方法。
