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1、一种用于生物芯片标记效率的研究方法一种用于生物芯片标记效率的研究方法 (1)(1)作者：王治伟，马文丽，夏巍，杨琼，郑文岭 【摘要】 目的利用自杂交的方法对芯片杂交样品的标记效率进行检测和实验质控。方法提取人红白血病 K562 细胞RNA 后，将核酸样品等分成两等份，分别应用通用引物标记Cy3 和 Cy5 荧光物质，然后和制备的 K562 芯片进行杂交，通过比较杂交后探针上 Cy3 和 Cy5 的荧光信号强度，对样品的标记效率和杂交流程进行实验分析和质控。结果杂交后的芯片探针显示为等量的 Cy3 和 Cy5 重叠后的黄色荧光，由于样品是等量的同一种核酸物质，从而证明了样品标记的效率一致性较好。
2、结论通过自身杂交方法来比较相同样品两种荧光标记物的信号强度，对芯片本身的质量进行检测，分析标记物的标记效率，可以应用于生物芯片实验的质量控制。【关键词】 生物芯片;标记;杂交Abstract:Objective Toinvestigatetheeffectofselfhybridizationmethodofanalyzingsampleslabelingformicroarrayexperiment.MethodsThetotalRNAswereextractedandpurifiedfromK562cellstosynthesizedoublestrandedcDNAsbyreverset
3、ranscription.ThentwohomologoussampleswerelabeledwithtwodifferentfluorescentdyesCy3andCy5.Andthelabeledsampleswereexaminedwiththeprintedmicroarray.ResultsWiththesamequantityoffluorescenceCy3andCy5overlap,themicroarrayimageshowedalmostyellowcolor.Andtheselfhybridizationmethodcouldbeusedtocontroltheflu
4、orescencequality.ConclusionThemethodthatusedselfhybridizationmethodtoobtainqualitydatasetfromamicroarrayexperimentforassessmentofthemicroarrayandlabeledsamplesqualitycanbeusedinqualitycontrolofmicroarrayexperiment.Keywords:microarray;label;hybridization生物芯片实验是一个多阶段的实验流程，包括了从芯片的打印制备、样品的分离提取、荧光物质的标记、芯
5、片的杂交和扫描等1 。在实验中常常由于标记效率的差异影响实验结果，特别是表达谱芯片中两种样品的竞争性杂交，标记效率的不同会直接影响差异表达基因的分析。目前对于芯片的样品标记，结合统计学提出了很多实验后数据分析方法，但是从整体实验设计对样品标记效率直接分析，来对实验过程进行质量控制，还未见报道2，3 。本研究采用自身杂交的方法，将同样的实验样品分别用不同荧光物质标记后和芯片进行杂交，通过比较两种荧光物质的信号强度，对样品的标记效率进行评估和研究，从而为进一步应用基因芯片技术提供更好的途径。1 材料与方法11 材料人红白血病 K562 细胞株由广州军区总医院医学实验科提供；总 RNA 提取试剂（T
6、rizol）及 PCR 产物纯化试剂盒购自上海博彩生物工程公司；mRNA 纯化试剂、荧光染料Cy3、Cy5dUTP 购自 Pharmacia 公司；限制性内切酶Sau3A、Taq 酶、T4DNA 连接酶、RnaseH 等购自 Takara 生物技术公司；CMTGAPS 表面氨基化玻片购自 Corning 公司；DMSO 及 Formamide 购自 Amresco 公司。12 细胞培养 K562 细胞常规培养（37，5%CO2）于含 10%（）的精制小牛血清和青霉素、链霉素各 100u/mL 的RPMI1640 培养基中。靶基因片段的制备 应用 RDPCR 技术构建 K562 细胞正常状态下的
7、 cDNA片段文库4 ，从中选择克隆扩增。PCR 产物经纯化后，紫外分光光度计 DU530 测定浓度，用 DMSO 调整浓度为mg/mL，加样至 384 孔板中备用。芯片的制备 一种用于生物芯片标记效率的研究方法用CartesianPixsys5500 基因芯片打印仪和 CMTGAPS 玻片进行点样，然后在 BIORAD 紫外交联仪下以 150MJ 的总能量进行交联固定，80干烤 2h 后备用。杂交样品的制备细胞总 RNA 的提取 具体实验步骤参照试剂盒说明，分别提取 2 次培养细胞的总 RNA。mRNA 的纯化 mRNA 纯化采用 PharmaciamRNA 纯化试剂盒。取40gRNA 加入
8、 1mL 的 Elutionbuffer 悬浮,Oligo（dT）Cellulose 沉淀，室温混匀 10min 以上，16000r/min 离心 10s，弃上清液。先用 Highsaltbuffer 洗涤沉淀 5 次，再用 Lowsaltbuffer 洗涤 3 次。用 mLLowsaltbuffer 重悬,Oligo（dT）Cellulose 沉淀，转移到离心柱中，16000r/min 离心 10s，洗 2 次。用 mL65预热的Elutionbuffer 洗脱 2 次，收集 2 次流出液，DU530 紫外分光光度仪进行定量。（作者：未知本文来源于爬虫自动抓取，如有侵犯权益请联系 service立即删除）
