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1、本科学生综合性实验报告 学号：104120265 姓名：段昌福 学院： 生命科学学院专业、班级： 10 应用生物教育 B 班 实验课程名称：胡萝卜肉质根愈伤组织诱导、继代增殖、细胞 悬浮及体细胞胚胎发生培养实验 教师：杨世忠 开 课 学 期：2013 至2014 学年第二学期 填 报 时 间：2013 年6 月日 云南师范大学教务处编印 1 一实验设计方案 实验序号实验二实验名称 胡萝卜肉质根愈伤组织诱导、继代增殖、细胞 悬浮及体细胞胚胎发生培养实验 实验时间2013 年 3 月-6 月实验室组培实验室 （一） 、实验目的 1. 熟练掌握配制与保存培养基母液的基本技能。 2.熟练掌握培养基配制
2、的基本技能，并能根据实验目的设计适合的培养基配 方。 3.学会设计和配制胡萝卜愈伤组织增殖培养基。 4.熟练掌握外植体的表面消毒技术和无菌操作技术。 5.掌握组培室常用的化学试剂。 6.学会设计和配制胡萝卜细胞悬浮培养的培养基。 7.熟练掌握愈伤组织继代培养的基本操作技术。 8.使同学熟练掌握胡萝卜细胞悬浮培养的基本操作技术，进一步熟悉、规范无 菌操作技术。 9. 使同学了解胡萝卜愈伤组织器官分化培养的基本操作技术。 （二） 、实验原理、实验流程或装置示意图 1、实验原理 （1）配制培养基时， 为了使用方便和用量准确， 通常采用母液法进行配制， 即将所选培养基配方中各试剂的用量，扩大若干倍后再
3、准确称量，分别先配 制成一系列的母液置于冰箱中保存，使用时按比例吸取母液进行稀释配制即 可。 （2）愈伤组织（ callus）原指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新 生的组织。它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体任何器官内各种组织的 活细胞。在植物体的创伤部分，愈伤组织可帮助伤口愈合；在嫁接中，可促 使砧木与接穗愈合，并由新生的维管组织使砧木和接穗沟通；在扦插中，从 伤口愈伤组织可分化出不定根或不定芽，迸而形成完整植株。在植物器官、 组织、细胞离体培养时，条件适宜也可以长出愈伤组织。其发生过程是：外 植体中的活细胞经诱导，恢复其潜在的全能性，转变为分生细胞，继而其衍 生的细胞分化为薄壁组
4、织而形成愈伤组织。 愈伤组织诱导的成败关键主要不是外植体的来源和种类，而是培养条 件，其中激素的种类和浓度最为重要。 诱导愈伤组织常用的生长素是2， 4-D， IAA 和 NAA ，常用的细胞分裂素是KT 和 6-BA。 愈伤组织形成的过程分为3 个时期：诱导期、分裂期、分化期（形成期）。 愈伤组织的生长是发生在不与琼脂培养基接触的表面。 （3）调节培养基的酸碱性至PH5.8。由于培养基的 PH 值直接影响到培养 1 物对离子的吸收，因而过酸或过碱都对植物材料的生长有很大的影响。此外， PH 还影响到琼脂培养基的凝固情况。所以，当培养基配制好后应立即进行PH 值的调整。培养基若偏酸时用氢氧化钠
5、（1molL -1）来调节，若过碱就用盐 酸 （1molL -1）来调整。当 PH 值高于 6.0 时，培养基将会变硬；当 PH 值低 于 5.0 时 5.0 时，琼脂不能很好地凝固。 （4）植物组织培养的优点： 研究材料来源单一，无性系遗传背景一致； 经济方便效率高； 条件可控误差小； 生长快周期短重复性强； 可周年试验或生产。 （5）组织培养实验室布局的总体要求： 便于隔离，便于操作，便于灭菌，便于观察。 （6）组培上常用的灭菌方法有物理和化学法。 常用的物理方法有： 物理灭菌干热、湿热、射线处理、物理除菌、过滤、离心、沉淀等。 常用的化学方法：消毒剂、抗菌素灭菌。 不同物品要选用不同的灭
6、菌方法。 实验室中常用仪器设备及其灭菌方法如下： 培 养 基 灭 菌 ： 高 温 高 压 湿 热 灭 菌 法 。 具 体 方 法 如 下 ： 压力在 9.810410.8104Pa ，温度在 121，灭菌 2030min。 玻璃器皿灭菌：蒸汽高压消毒灭菌、干热消毒灭菌 塑料器皿灭菌：多采用高压蒸汽消毒灭菌 金属用具灭菌：灼烧灭菌。具体方法是：浸入95%酒精，后置于酒精火焰 上灼烧，冷却后使用。 接种室灭菌：紫外灯照射、空气消毒灭菌。 超净工作台：紫外灯照射，70%75%的酒精擦洗。 外植体灭菌： 水冲洗 1020min 或更长时间70%75%酒精中浸泡 30s 0.1%0.2%氯化汞液中浸泡1
7、0min 左右蒸馏水冲洗 45 次备用。 2 2、实验流程 （1）实验总体流程： （2）无菌操作流程： （3） 胡萝卜愈伤组织诱导培养流程： (4)胡萝卜愈伤组织的继代培养流程： （三） 、实验设备及材料 1、实验材料 新鲜的胡萝卜贮藏根 2、实验设备 （1）配制 MS母液培养基所需的仪器设备和药品： 仪器设备： 电子天平、烧杯、容量瓶、细口瓶、药勺、玻璃棒、电炉、量筒。 药品： NH4NO3、 KNO 3、 CaCl2 2H2O 、 MgSO4 7H2O 、 KH2PO4、 KI、 H3BO3、 MnSO4 4H2O 、 ZnSO4 7H2O 、 Na2MoO42H2O 、 CuSO45H2
8、O 、CoCl26H2O 、FeSO47H2O 、 Na2-EDTA 2H2O 、肌醇、 烟酸、盐酸吡哆醇 (维生素 B6)、盐酸硫胺素 ( 维生素 B1)、甘氨酸、蒸馏水。 （2）配置胡萝卜愈伤组织诱导培养培养基所需的仪器设备和药品： 仪器设备： 冰箱、普通天平、三角瓶、移液管、量筒、烧杯、容量瓶、玻璃棒、医用口 杯、精密 pH试纸（ pH5.47.0） 、药勺、称量纸、标签纸、封口膜、橡皮筋、电 炉、高压蒸汽灭菌锅等。 药品和试剂： MS培养基母液、琼脂、蔗糖、生长调节物质、 蒸馏水、1mol/LHCl、1mol/LNaOH 3 （3）胡萝卜愈伤组织诱导所需设备： 仪器设备： 100ml三
9、角瓶、 500ml搪瓷杯、 25ml量筒、 10ml和 5ml吸管、 pH试纸 （5.47.0 ） 、 封口膜、扎口用棉线、药勺、称量纸、酒精棉球、小块纱布、已灭菌滤纸、枪状 镊子、手术剪、解剖刀、已灭菌培养皿、酒精灯、培养瓶、镊子、解剖刀等。 药品和试剂： MS基本培养基母液、愈伤组织诱导培养基、蒸馏水、无菌水、75酒精、 蔗糖琼脂、 NAA 、6-BA、水解酪蛋白、 1mol/LHCl、1mol/LNaOH 、0.1%HgCl2 。 （4）胡萝卜愈伤组织的继代培养所需设备： 仪器设备： 酒精棉球、小块纱布、已灭菌培养皿和滤纸、枪状镊子、眼科手术剪、手术 刀、酒精灯、 100ml 三角瓶、
10、500或 1000ml搪瓷杯、 50ml 量筒、1ml、2ml、5ml、 10ml 吸管、精密 pH试纸（ 5.47.0 ） 、封口膜、橡皮圈、药勺、称量纸等。 药品和试剂： 愈伤组织继代培养基、 75酒精、蒸馏水。 (四)、实验方法步骤 1、MS 母液培养基的配置 配置过程以课本33页的配方图为标准。 （1）大量元素的配置 (CaCl22H2O 要在最后单独加入 ) 用量=放大倍数 *体积*培养基中的浓度 n=20 v=1L （2）微量元素的配置 (Fe单独配置 ) N=200 v=1L （3）有机成分的配置（单一母液） N=200 v=250ml （4）铁盐母液的配置 螯合态的铁，混合煮沸
11、PH=5.8-6.2(用 NaOH 调) （5）生长调节物得配置 2-4-D：0.5mg/ml v=100ml 6-BA:0.1mg/ml v=100ml 4 NAA:0.5mg/ml v=100ml 注： 不能直接加入水中，可先用酒精或 NaoH2 溶解 2-4-D 或 NAA,用盐酸溶解 6-BA。 （6）其他常用试剂 :75%酒精。 2、胡萝卜愈伤组织诱导培养培养基的配置 配方如下： MS基本培养基 + 2 mg/LNAA +0.1 mg L 16BA + 200 mg L1 水解酪蛋白 + 3% 蔗糖 + 0.7% 琼脂粉 配制体积：各小组500ml 即 大量元素 :50 ml; 微量
12、元素：5 ml; 有机物成分： 5 ml; 铁盐：5 ml; 2 mg/L NAA：2mg(2ml); 0.1 mg/L6BA:0.1mg (1ml); 200 mg/L水解酪蛋 白:200mg; 蔗糖:30g; 琼脂： 7g。 配制流程： (1) 根据需要配制培养基的量（各小组500ml）称好所需的琼脂放入医用口 杯中，加入适量的蒸馏水置于电炉上加热溶解，边加热边用玻棒搅拌。 (2) 待琼脂完全溶解后，加入规定用量的母液（可事先取好放在一烧杯中）， 再加入规定用量的蔗糖，继续加温并不断搅拌，待琼脂煮透后端离火源，根据 培养基配方及培养基体积加入所需的生长调节物质，定容至所需的体积，并用 玻棒
13、搅拌均匀。 （3）调节培养基的酸碱性至PH6.0。用玻璃棒蘸取溶液，借助PH试纸检测 pH ，用 NaOH 和 HCl 调节 PH 。 （4）配制好的培养基要趁热分装，试管、三角瓶等培养基的容器加注量应 占容积的 1/31/4 ， 三角瓶每瓶 40 毫升左右，共分成 12瓶。太多既浪费培养基， 又减少了培养材料的生长空间；太少又会因营养不良影响生长。培养基分装完， 用封口膜封严瓶口，并用橡皮筋扎紧。 （5）培养基的灭菌消毒 灭菌时，压力表读数为0.11MPa,温度 121时保持 30 分钟左右即可。为 了保证灭菌彻底，在蒸气灭菌锅增压之前应先将灭菌锅内的冷空气放尽。排净 冷空气的方法：可事先打
14、开放气阀，煮沸等大量热蒸汽排出后再关闭；也可采 用先关闭放气阀，待压力升到一定时打开放气阀排出空气，再关闭放气阀。 （6）培养基冷凝后，标记，并置于暗处放置3-7 天备用。 5 3、 胡萝卜愈伤组织诱导 （1） 、实验材料的准备 、材料的修整、刷洗、冲洗。 、用小刀刮去胡萝卜外表皮，横切取高约1cm的圆柱形胡萝卜块3 块。 （2） 、准备工作 、打开超净工作台和无菌操作室的紫外灯，照射40min 左右，后关闭。 、开启过滤室风机，使无菌风吹拂工作台面和四周的台壁。 、用 70% 75% 的酒精擦拭工作台和双手。 、用沾有 70% 75% 酒精的纱布擦拭盛培养基的培养器皿，放进工作台。 、把解剖
15、刀、剪刀、镊子等器械浸泡在95% 的酒精中，再在火焰上消毒，放 在器械架上。 、在酒精灯火焰附近切割备用的接种材料。 、打开瓶口，用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶口各部分都烧到。 、取下接种器械，在火焰上消毒。 （3） 、植物材料表面的灭菌与接种 、工作人员消毒。 、装材料的容器及玻璃棒用酒精进行表面消毒。 、将待消毒材料浸入75% 酒精中 10 秒，取出用无菌水冲洗。 、移入消毒液HgCl2并计时。 （10-15min） 、倒出消毒液。 、倒入无菌水清洗后备用。 （4） 、接种与培养 、将经消毒的胡萝卜块去除外侧部分后，每一块再切成四小块，给别接种到 3 个盛培养基的三角瓶内。 、培养瓶封口后置于
16、恒温培养箱中全黑暗培养。温度控制在25左右。 、接种结束后，清理和关闭超净工作台。 4、胡萝卜愈伤组织的继代培养 （1） 、准备工作 接种室的清洁和消毒；超净工作台的开机和消毒；剪刀、镊子、已灭菌培 养皿和滤纸、待用培养基等的准备；实验材料的准备（选择装有无污染的已分 6 化出愈伤组织的外植体的三角瓶摆放于超净工作台）。 （2）愈伤组织继代培养 将上次接种在愈伤组织诱导培养基中的无污染的外植体上产生的愈伤组织 剥离转接到愈伤组织继代诱导培养基上，封口后放置在 25 全黑暗条件进行愈 伤组织的继代培养，以获得足够的愈伤组织，作为后续实验的实验材料。 （五） 、注意事项 1、调节培养基时，理论上应调至5.8 为宜，但因培养基经高温高压灭菌时， 蔗糖分解， PH值会有所下降，因此调至6.0 可减小误差。 2. 防火。实验中要经常用酒精消毒、用酒精灯烧镊子、刀具，注意安全。 3. 无菌操作。材料经 HgCl2
