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1、声明,1.本PPT由脐带间充质干细胞对CIA大鼠炎症因子的干预一文改编。 2.本PPT所涉及资料和图象均仅用于学习参考，不得用于商业目的或其它目的。 3.若使用本PPT所涉及资料和图象，应向相关拥有知识产权使用权的网站购买，并标明出处。,脐带间充质干细胞对CIA大鼠炎症因子的干预,演讲者：blueappleboy,脐带间充质干细胞对CIA大鼠炎症因子的干预,背景：脐带间充质干细胞可表达多种胚胎干细胞的 特有分子标志，具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低等特征。 目的：观察脐带间充质干细胞对类风湿性关节炎免 疫炎性的病理过程的干预作用。 方法：实验分为3 组，建立型胶原诱导的类风湿性关节炎模型
2、大鼠，脐带间充质干细胞组于造模后第4 周经大鼠尾静脉注射脐带间充质干细胞，模型组注射生理盐水。,引言,类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)时白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素18、肿瘤坏死因子a(tumor necrosis factor-a， TNF-a)等炎症因子相互作用形成了一个细胞因子网络。其主要功能是促进B细胞增殖与分化，促进类风湿因子的合成，促进肝细胞合成急性期蛋白，从而增强炎症过程，加重关节病变。它们亦可直接损伤内皮细胞，激活血小板，影响纤溶系统等，同时诱导内皮细胞、白细胞等合成释放各种炎症递质、黏附分子扩大炎症反应，加重免疫炎性血管和关节损伤，促
3、进血液呈高凝性改变。,脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，Uc-MSC)表达多种胚胎干细胞的特有分 子标志，具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性 低、取材方便、不受道德伦理限制等特征受到临床 关注。课题以CIA大鼠为观察对象，探讨RA炎症黏 附因子水平变化及Uc-MSC对其的干预作用。,材料和方法,设计：随机对照动物实验。 时间及地点：实验于2009-09/2010-06在扬州 大学医学院完成。 材料：雌性近交系SD大鼠30只，清洁级， 46周龄，体质量为(16220) g，购于南京医 科大学实验动物中心。,主要试剂,试剂及仪器 来源
4、鸡型胶原 Sigma 公司 冰乙酸(分析纯) 中国恒利试剂厂 L-DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶 美国 Gibco公司 大鼠白细胞介素 1、大鼠白细胞 美国 RD公司 介素 6、大鼠白细胞介素 18 ELISA 试剂盒、大鼠 TNF-a ELISA 试剂盒、大鼠血管细胞 黏附分子 1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1) ELISA 试剂盒、FITC Mouse Anti-Rat CD11b、FITC Mouse lgA,实验方法,Uc-MSC的制备：将人的脐带剪成组织块后贴 壁培养72 h，去除未消化的组织块，将原代脐 带间充质干细胞用胰蛋白酶消化
5、后加入含有体 积分数10%胎牛血清的L-DMEM培养基终止消 化，反复吹打，移入离心管中离心10 min后， 去掉上清液，加入培养基后吹打，移入培养瓶 中，37 、体积分数5%CO2培养箱中培养， 至第3代消化、离心后用生理盐水将Uc-MSC细 胞浓度调至2109L-1，4 保存备用。,CIA大鼠模型建立：雌性近交系SD大鼠，随机分为正常组(见 图1a)、模型组(见图1b)、Uc-MSC组，每组10只。制备0.01 mol/L乙酸溶液中溶解的鸡源性型胶原 (质量浓度为5 g/L)， 充分溶解后与完全弗氏佐剂(CFA)等体积混合，并充分乳化成 型胶原乳剂。予20只大鼠右后足跖皮内注以0.1 mL
6、免疫大 鼠，第21天时再次以每只0.1 mL的剂量同部位皮内多点激发 注射免疫大鼠，建立型胶原诱导的类风湿性关节炎大鼠模型。 各组大鼠处理：取Uc-MSC 2109L-1，于造模后第4周Uc- MSC组经大鼠尾静脉注射，模型组注射生理盐水0.5 mL。,Uc-MSC表型鉴定： 采用流式细胞术对CD14、CD34、 CD44、CD45、CD73、CD90、CD105及HLA-DR表面标记 进行表型分析， 其中CD44、CD73、CD90和CD105阳性， 阳性率95%；CD14、CD34、CD45和HLA-DR阴性，阳性 率2%，确认为Uc-MSC细胞。 指标检测：模型组和Uc-MSC组分别于第
7、7天及第35天每组 各取5只大鼠麻醉，于腹主静脉取血5 mL，分别置肝素抗凝 管和血清管中，检测中性粒细胞表面CD11b(FCM法)和血清 白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素18、 TNF-a、 VCAM-1水平(ELISA法)。流式细胞术检测各组大鼠中性粒细 胞表面CD11b MFI表达。,主要观察指标：各组大鼠血清白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素18、TNF-a、VCAM-1 水平。各组大鼠中性粒细胞CD11b的表达水平。各组大鼠中性粒细胞表面CD11b MFI表达。 统计学分析：采用SPSS 10.0及Excel 2003 统计学软件完成。组间比较采用方差分析，P 0.05为差
8、异有显著性意义。,结果,实验动物数量分析 实验选用大鼠30只，分为3 组，无脱 失，全部进入结果分析。各组大鼠血清白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素18、 TNF-a、VCAM-1水平： 模型组CIA大鼠血清白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介 素18、TNF-a、VCAM-1水平明显增高于正常组 (P 0.05)； Uc-MSC组经治疗后血清白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞 介素18、TNF-a、 VCAM-1水平较模型组差异有显著性意义(P 0.05)，治疗前后比较差异有显著性意义(P 0.05)，见表1。,各组大鼠中性粒细胞表面CD11b的表达水平 模型组CIA大鼠中性粒细胞表面C
9、D11b的表达水平明显增高 (P 0.05)；Uc-MSC治疗后第35天中性粒细胞表面CD11b 的表达水平有显著改变(P 0.05)，流式细胞术检测中性粒、 细胞表面CD11b，见图2，3。,讨论,实验发现CIA大鼠模型组上述炎症因子等水平明显高于正常 组，认为CIA大鼠发病过程中存在炎症网络因子释放增加， 是参与RA免疫性关节炎的病理过程形成的重要因素，促进 RA临床症状的发生和加重，因此，炎症因子指标对RA患者 的病情判断、治疗效果和预后有意义。 迄今研究认为，脐带来源的间充质干细胞不但能够成为骨髓 间充质干细胞的理想替代物，而且具有更大的应用潜能。由 于P3代间充质干细胞的活性最强，故
10、本实验选用P3代间充 质干细胞，干预CIA大鼠病理情况下高水平炎症网络因子表 达。,间充质干细胞具有很强的趋向炎症和损伤部位特性，在动物 实验被证实。间充质干细胞这种在体内微环境的作用下主动 迁移(即损伤趋化作用)到受损伤部位进行修复称为间充质干 细胞的 “归巢”作用。在体外间充质干细胞介导的免疫调节作 用的研究中发现，间充质干细胞通过T细胞、B细胞、DC细 胞、以及NK细胞等多个环节完成机体免疫调节作用，调节细 胞因子的表达。而类风湿关节炎的病理基础主要是由T细胞 介导涉及B细胞、细胞因子、细胞凋亡、蛋白酶等多种因素 所致自身免疫性疾病，因此，应用间充质干细胞治疗而干预 RA炎症病理基础成为
11、可行。,实验发现经Uc-MSC治疗后的CIA大鼠血清白细胞介素1、白细胞 介素6、白细胞介素18、肿瘤坏死因子a、VCAM-1水平较模型组 有不同程度的降低，可见间充质干细胞能够通过其趋化作用到达 炎症部位，进而通过对T细胞及B细胞的免疫调节作用进行调控， 从而抑制炎症因子的表达。且CIA大鼠中性粒细胞表面CD11b平均 摄取率明显低于模型组，影响CIA大鼠中性粒细胞表面CD11b表达 峰值，使其明显左移，提示Uc-MSC能使炎症因子及中性粒细胞表 面CD11b的表达降低，抑制类风关病理性炎症因子释放及内皮细 胞的异常活化，使炎症因子及中性粒细胞表面CD11b的表达降 低，有利于缓解症状和改善RA的免疫炎性。因此，作者认为上述 因子可作为评价Uc-MSC临床治疗效果的实验指标。 实验初探Uc- MSC治疗RA的结果，反映间充质干细胞干预RA致病性炎症因子 释放及内皮细胞的活化作用，有利于修复RA免疫炎性致畸性关节 功能异常。,谢 谢,
