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1、,微生物学检验,第十四章 真菌检验技术,返回总目录,本 章 内 容,学习目标及重点,学习目标： 掌握真菌的检验方法 熟悉真菌标本采集及注意事项；真菌的鉴定程序；真菌药物 敏感试验方法 了解常用抗真菌药物 本章重点： 临床真菌标本的采集和处理真菌的形态学检查、培养技术和鉴定试验真菌药物敏感试验,第一节 真菌形态检验技术,一、标本的采集和处理1. 标本的采集根据真菌感染部位采集不同的标本,取毛发、皮屑、指（趾）甲等标本,取痰液、脓汁、血液、脑脊液等标本,2. 标本采集注意事项,第一节 真菌形态检验技术,临床标本,分离培养,直接检查,免疫学检查,观察菌落,生化反应,染色 镜检,直接 镜检,3. 检验
2、程序,核酸检测,其他鉴定试验,形态学检查,病理组 织标本,动物实验,镜检,PAS,HE,第一节 真菌形态检验技术,二、直接镜检,标本处理液： （1）KOH溶液 适于检查致密的难以透明的材料 （2）生理盐水 用于观察真菌的出芽现象 （3）水合氯醛-石炭酸-乳酸封固液 透明力较强，只限于不透明的标本,镜检,注意真菌与其他混杂物的鉴别,第一节 真菌形态检验技术,三、染色镜检 革兰染色：各种真菌均为革兰阳性（图1） 乳酸酚棉蓝染色：染成蓝色（图2） 墨汁染色：背景染成黑色，菌体不着色（图3） 荧光染色：荧光显微镜下发出荧光 糖原染色：多糖成分呈红色，核为蓝色，背景为淡绿色,返回章内容,（图1）,（图3
3、）,（图2）,第一节 真菌形态检验技术,第二节 真菌培养技术,一、基本条件1.常用工具 平皿、试管、接种针、接种环、接种钩、培养箱等,一、基本条件2.培养基 真菌营养要求不高，最适pH 4.06.0常用的培养基:,第二节 真菌培养技术,显色鉴定培养基,真菌特异性酶的底物（无色）,产色基团游离（显色）,真菌的酶分解代谢基质,原理,第二节 真菌培养技术,第二节 真菌培养技术,二、培养方法,仅用于培养生长繁殖较快的真菌,观察真菌结构及生长发育过程,多用于菌种传代接种与保存,第二节 真菌培养技术,三、生长现象,类酵母型菌落,丝状菌落,观察菌落,生长速度、菌落大小、表面形态、性质、颜色、边缘、底部等,酵
4、母型菌落,返回章内容,第二节 真菌培养技术,一、常用生化试验,第三节 真菌的鉴定方法,二、免疫学检查,第三节 真菌的鉴定方法,三、其它鉴定诊断方法l. 厚膜孢子形成试验,接种,玉米粉吐温-80琼脂,25孵育13天,待测菌,每天于显微镜下观察,应用：白假丝酵母菌的鉴定,方法：,结果：白假丝酵母菌在72小时内可观察到丰富的假菌丝，假菌丝顶端见12个厚膜孢子,第三节 真菌的鉴定方法,2.芽管形成试验,方法： 待测菌+0.51ml血清,37水浴23小时,镜检,应用：白假丝酵母菌的鉴定,三、其它鉴定诊断方法,结果：绝大部分白假丝酵母菌可形成典型的放大镜柄状芽管,芽管,第三节 真菌的鉴定方法,三、其它鉴定
5、诊断方法,3. 动物接种,4. 病理组织检查,5. 核酸检测,6. 真菌毒素的检测,用于分离病原性真菌、确定真菌的致病性、研究抗真菌药物,用于深部真菌感染的诊断,用于真菌的分型鉴定,有ELISA、生物学方法、薄层层析法、高效液相色谱法等多种方法,7. G试验,用于念珠菌、曲霉菌等深部真菌感染的早期诊断,返回章内容,第三节 真菌的鉴定方法,第四节 真菌药物敏感试验,一、临床常用抗真菌药物,第四节 真菌药物敏感试验,二、酵母菌药敏试验方法微量稀释法1试验前准备,RPMI 1640培养基 （含L-谷氨酰胺、酚红，不含碳酸氢钠）,培养基,第四节 真菌药物敏感试验,2方法,第四节 真菌药物敏感试验,3结果判断,4. 质量控制采用标准菌株作为每次测定质控菌株，其MIC应落在预期值范围内,第四节 真菌药物敏感试验,二、酵母菌药敏试验方法纸片扩散法1试验前准备,商品化含药物纸片,药物纸片,用无菌生理盐水调整至0.5麦氏单位,待检菌液制备,含葡萄糖和亚甲蓝的M-H琼脂,第四节 真菌药物敏感试验,二、酵母菌药敏试验方法纸片扩散法2方法,用无菌棉签蘸取菌液,35孵育1824小时 若生长不良可延长至48小时,贴上药物纸片,均匀涂布接种M-H琼脂,第四节 真菌药物敏感试验,4.质量控制标准质控菌株的抑菌环直径必须在质控允许范围,二、酵母菌药敏试验 方法纸片扩散法,返回章内容,第四节 真菌药物敏感试验,
