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1、第三章 免疫酶组织化学技术,免疫酶组织化学技术 酶-辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶 酶标记已知Ab(或Ag) + 组织细胞内相应的Ag(或Ab) 抗原抗体复合物(酶标) 底物 有色沉淀 定位； 图像分析仪半定量,免疫组化方法,酶标抗体免疫组织化学 直接法 间接法 非酶标抗体免疫组织化学 酶桥法 PAP法、APAAP法,一、酶标抗体免疫组织化学染色法 （一）原理 直接法和间接法。 直接法- 是将酶标记在第一抗体上,直接检测细胞内特异性抗原。 间接法-两步法 一抗：是细胞组织内抗原的特异性抗体； 二抗：是抗一抗的抗体,并且已用酶标记。 (注意:第二抗体与第一抗体须是不同种属动物制备的,因为第二抗体往往
2、是用第一种动物的IgG所制备。),原理：将酶直接标记在一抗上，然后直接与相应抗原特异地结合。形成抗原-抗体-酶复合物，最后用底物显色剂显色。 优点：简便、快速、特异性强，非特异性背景反应低。 缺点：浪费抗体、敏感性极低。 依靠化学连接（共价键）对酶及抗体活性有影响。 每种抗原必须分别用其抗体的酶标记物。,酶标抗体法-直接法,酶标抗体法-间接法,原理：将酶标记在二抗上，先将一抗与相应的抗原结合，形成抗原抗体复合物，再用二抗(酶标抗体)与复合物中的特异抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，最后用底物显色剂显色。 优点：只需一种酶标抗体即可 。 缺点：敏感性低，但优于直接法。 依靠化学连接对酶及
3、抗体活性有影响。,免疫酶组织化学方法最终的生成物是带有酶标记的抗原抗体复合物，再依据酶与底物作用生成不溶性的有色产物沉积在抗原抗体反应原位，并借此确定该抗原的性质、存在的部位和含量。 酶 + 底物=不溶性的色素 标记酶: 辣根过氧化物酶 (HRP) 碱性磷酸酶(ALP) 葡萄糖氧化酶(GOD) -D-半乳糖苷酶,显色反应 :,1 辣根过氧化物酶 HRP： 显色：产物棕褐色 HRP与底物过氧化氢和DAB作用产物棕褐色，有嗜锇性。 DAB性质： 电子供体，较敏感，室温时较稳定，显色后切片可长期保存。可致癌，可将DAB制成10倍浓度储存液，分装后-20贮存。 注意事项：孵育时间和配置方式易产生背景着
4、色 浓缩的DAB按照说明书；注意校正蒸馏水的PH值； 粉剂DAB-溶解时滤去不溶性颗粒； 现用现配-保存时可产生氧化物沉积在切片上，形成斑点。 临用前加H2O2,2 碱性磷酸酶 ALP： 显色：产物蓝色或红色。 以磷酸萘酚AS-MX为底物，被ALP水解后生成萘酚AS-MX，再与孵育液内的坚牢蓝B盐或坚牢红TR盐等偶联生成不溶性染料(坚牢蓝或坚牢红)而成。 优点：细胞和组织内的内源性碱性磷酸酶很容易被抑制和破坏，而不会产生内源性酶显色，从而提高特异性。 缺点：显色弥散，不如过氧化物酶系统的清晰和明确。,3 GOD(葡萄糖氧化酶)： 以-D-葡萄糖底物，被GOD氧化生成的H2O2，又作为HRP的催
5、化底物，最后仍可用DAB显色。 适用于两种酶的放大技术： 即用GOD和HRP分别标记第二和第三抗体(如第一抗体是小鼠mAb，第二抗体为GOD标记的兔抗小鼠IgG，第三抗体为HRP标记的羊抗兔IgG)，孵育液即含有葡萄糖，又含有DAB，此法可提高免疫染色的敏感性和特异性。,呈色反应注意要点： 底物浓度： 应够高，保证最大反应速度; pH值： 满足酶活性的最适pH，常由缓冲液提供; 温度： 室温即18-22，或37； 时间： 显色反应时间应在镜下观察来控制， 以特异性显色清晰而背景又无非特异性着色时即可终止反应。,（二）染色程序 1 直接法（冰冻切片） 1）新鲜组织切片,冷丙酮固定10min,干燥
6、后,入PBS。 2）0.3H2O2 -甲醇液处理30,封闭内源性过氧化物酶; 3）0.0l molLPBS洗3次。 4) 5-10正常羊血清室温处理30min。 5) 1:50-1:100 HRP-标记抗体, 37孵育60或4过夜。 6) 0.0l molL PBS洗3次。 7) DABH2O2显色(新鲜配制)。 8) 0.01molLPBS洗3次。 9) 梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片。,2 间接法 1) 石蜡切片脱蜡至水； 冰冻切片 室温干燥-丙酮固定-缓冲液漂洗溶去OCT包埋剂 2) 甲醇双氧水室温处理切片1530min,封闭内源性过氧化物酶活性。 3) PBS漂洗 4) 0.11牛血清
7、白蛋白(BSA),湿盒内室温孵育1525,然后吸去孵育液,不冲洗. 5%10正常兔血清(或山羊血清),湿盒内室温孵育1520然后吸去。 5)滴加PBS适当稀释的第一抗体,湿盒内孵育,或4过夜,或室温24h。,6) PBS充分冲洗 7) 滴加适当稀释的酶标第二抗体,湿盒孵育4560(室温或37)。 8) PBS漂洗(3次,每次2-5)。,9)显色： HRP标记抗体（0.01-0.1% H2O2 + 0.01-0.5DAB液） ALP标记抗体 （2mg磷酸萘酚AS-MX+0.2ml二甲基甲酰胺，用前加坚牢红TR盐)。 切片入此液,室温1015。 GOD标记抗体 （-D-葡萄糖67mg + 硝基蓝四
8、唑6.7mg+吩嗪甲硫酸酯0.107mg， 37孵育1h。,10) 流水中终止呈色反应； 11) 复染细胞核（甲绿、苏木精）；10s 12) DAB显色标本-树胶封固。 其它-水溶性介质(如甘油明胶)封固。 13) 镜检结果：按上法HRP阳性者呈棕色，ALP法阳性者呈红 色，GOD法阳性者呈蓝色。,二、非酶标抗体免疫组织化学染色法 酶桥法、过氧化物酶抗过氧化物酶法 PAP,(一) 酶桥法 1 原理：三种抗体 一抗 二抗-桥抗体 三抗-抗酶(HRP)抗体, 酶(HRP)与抗酶抗体结合,经底物的显色反应将抗原显示出来。 优点：任何抗体均未被酶标记,酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合, 避免因共价结合
9、对抗体和酶活性的影响,敏感性高, 可节约一抗。 需要同一种属动物制备一抗和抗酶抗体。,非标记抗体酶法 酶桥法,原理：首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体；以二抗作桥，将抗酶抗体联结在一抗上； 再将酶结合在抗酶抗体上，形成抗原-抗体1-抗酶抗体-酶复合物，最后用底物显色剂显色。 优点：任何抗体均未被酶标记。酶是通过免疫学原理与酶抗体结合的。避免了共价连接对抗体和酶活性的损害，提高了方法的敏感性，而且节省一抗的用量。 缺点：敏感性低，抗酶抗体不易纯化。,2 酶桥法染色程序 同上述酶标抗体法。 滴加第一抗体,于湿盒内4孵育1624h。 PBS洗2次，每次5(可振摇)。 加第二抗体(桥抗体
10、),湿盒内室温孵育3060。 用PBS洗2次,每次5。 加抗酶(HRP)抗体,湿盒内室温孵育3060。 用PBS洗2次,每次5。 加过氧化物酶(HRP)溶液(70100gm1),湿盒内室温 孵育30。 用PBS洗2次,每次5。换Tris缓冲液洗5。 显色反应及后处理同酶标记法。,酶桥法的缺点： 抗酶抗体内存在低亲和力和高亲和力两类抗体； 低亲和力抗酶抗体-与酶结合力较弱，漂洗时易解离，可使约70的酶丢失，因而降低了方法的敏感性； 在抗酶抗体内，也含有非特异性(抗酶)抗体，因其抗原性与抗酶抗体相同，故也可与桥抗体结合，由于其未与酶结合，也会影响细胞组织内抗原的显示。,(二) PAP法（过氧化物酶
11、抗过氧化物酶法） PAP复合物： 抗酶抗体 + 足量的酶 = 形成稳定的五角形复合物 (由三个过氧化物酶分子和二个抗酶抗体分子组成) 原理：三种抗体 PAP复合物代替了酶桥法中的抗酶抗体。 一抗 二抗-桥抗体 PAP复合物 要求： 抗酶抗体的动物种属应和制各第一抗体的动物相同。,非标记抗体酶法 -PAP法,双PAP法,原理：同酶桥法，只是把抗酶抗体-酶制成复合物（PAP复合物），形成抗原-抗体1-PAP复合物。 优点：比直接法、间接法、酶桥法更敏感。特别适用于石蜡切片中微量抗原和抗原性减弱抗原的检测。 缺点：步骤较多，时间较长，不适用于临床常规检查。,优点： PAP复合物结构很稳定，冲洗时酶分
12、子不会脱落，灵敏度高，比酶桥法高20倍； PAP是一种复合物，无游离免疫球蛋白存在，不易引起非特异性染色； 双PAP法：通过两次连接桥抗体和PAP复合物，在抗原抗体复合物上结合了更多的酶分子，使敏感性大大增强，更适用于常规石蜡切片中微量和抗原性减弱的抗原检测。 缺点： PAP复合物制备较复杂； 免疫染色步骤多、需时长； 由于PAP复合物分子量较大，对组织的穿透力不如酶标抗体，故不适 于免疫电镜标本制作。,2 PAP染色程序 同上述酶标抗体法。 加第一抗体,湿盒内4孵育1624h。 用PBS洗2次,每次5min,可振摇。 加桥抗体(即羊抗兔IgG),湿盒内室温孵育30 用PBS洗2次，每次5，可
13、振摇。 加PAP复合物(由兔制备抗酶抗体),湿盒内室温孵育3 用PBS洗2次,每次5。再换入Tris缓冲液洗5。 用TBS配制的H2O2-DAB底物显色510(镜下观察控制)。 流水冲洗。, 需要时可复染细胞核。 脱水、透明、封固。,双PAP法染色程序： 同PAP法。 用PBS洗2次，每次5min。 再加桥抗体(羊抗兔IgG抗体，比第一次稀释大一倍)， 湿盒内室温孵育30min。 PBS洗2次，每次5min。 再加PAP复合物(比第一次稀释大一倍)，湿盒内孵育 30min。 以后按上述PAP法1215进行。,其它免疫组化方法,免疫组化技术成熟的过程=提高IHC敏感性=提高放大信号=抗原+？酶
14、生物素(Biotin) ：Vitamin H、 活化后可标记抗体和酶而不影响其活性 卵白素(Avidin):亲和素、抗生物素 碱性蛋白质；具有4个生物素结合位点 链霉卵白素： 从链霉菌中提取出来，等电点接近中性，对组织细胞的非特异吸附很低，是与生物素结合更加完美的一种蛋白质。 生物素-卵白素、生物素-链霉卵白素： 具有高度亲和力，是抗原抗体结合能力的上千倍。,ABC法 、SP法、SABC法、EnVision法、CSA法,ABC法（亲和素生物素过氧化物酶复合物法） 亲和素Avidin: 糖蛋白，其上有四个与生物素相结合的位点。 生物素Biotin：维生素H，两者亲和力巨大，牢不可破。 ABC法与
15、PAP法的区别是：以ABC复合物代替PAP复合物。 1）ABC复合物的制备：,ABC法反应原理,ABC染色程序 同上述酶标抗体法。 加第一抗体,湿盒内4孵育1624h。 用PBS洗2次,每次5min,可振摇。 加生物素化抗体(即羊抗兔IgG),湿盒内室温孵育30 用PBS洗2次，每次5，可振摇。 加ABC复合物(亲合素一生物素过氧化物酶复合物 ),湿盒内室温孵育3 用PBS洗2次,每次5。再换入Tris缓冲液洗5。 用TBS配制的H2O2-DAB底物显色510(镜下观察控制)。 流水冲洗。, 需要时可复染细胞核。 脱水、透明、封固。,SP/SAP法 该法是ABC法基础上的进一步改良. 与链霉卵
16、白素（而非生物素）结合，而后再结合PO。它有四个亚基可与生物素结合，灵敏度特异，背景低，成本低。 优点：更简洁，放大倍数，等电点中性更适合组织。 分子量小，穿透力。,一抗 + 生物素标记二抗 + 辣根酶标记链霉卵白素 + 辣根酶底物显色,其它免疫组化方法-SP,原理： + 一抗 + 生物素化二抗 + HRP标记的链霉卵白素 优点： 高灵敏度 低背景 操作方便 缺点： 不适用于内源性生物素丰富的组织,（过氧化物酶标记的链霉卵白素/过氧化物酶标记的碱性磷酸酶染色),三步法（以SP试剂盒为例） 石蜡切片脱蜡至水。 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。 3%H2O2室温孵育
17、5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，2分钟3次。 5-10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37孵育1-2小时或4过夜。 PBS冲洗，2分钟3次。 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37孵育10-30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37或室温孵育10-20分钟。 PBS冲洗，2分钟3次。 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37孵育10-30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37或室温孵育10-20分钟。 PBS冲洗，2分钟3次。 显色剂显色（DAB或AEC）。 自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。,
