原位杂交技术

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1、核酸分子杂交-原位杂交,第18讲,原位杂交的地位,免疫学检测技术 免疫组织化学法 免疫印迹法（Western blot） 酶联免疫吸附检测（ELISA） 放射免疫检测,分子生物学技术 PCR 多重PCR 实时荧光定量PCR Southern blot Northern blot 斑点杂交 原位杂交 生物芯片,在一定的条件下，应用标记抗体（抗原）与组织切片或细胞标本中的抗原（抗体）发生反应。如果组织或细胞中含有相应抗原（抗体），二者结合形成抗原抗体复合物，其中所带的标记物如酶或荧光素遇到底物或激发光时产生显色反应，在显微镜（包括普通光镜、荧光显微镜和电子显微镜）下，就可以原位确定组织中或细胞内抗

2、原的分布位置和性质；经图像分析也可达到定量的目的。,具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下按碱基互补原则退火形成双链。此杂交过程是高度特异性的，但杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补。杂交的双方是待测核酸序列及探针。将核酸从细胞分离纯化后可在体外与探针杂交，也可直接在细胞或组织内进行原位杂交。,免疫组化,核酸分子杂交,基本内容,一、原位杂交的基本原理 二、原位杂交的分类 三、发展起的新技术 四、原位杂交的特点 五、基本步骤 六、在遗传学研究中的应用 七、课堂小结 八、作业,一、原位杂交的基本原理,原位杂交是基于DNA分子变性和复性原理而发展起来的一种技术。两条不同来源的但具有同

3、源性的核苷酸单链片段在适宜的条件下能够按照碱基互补配对原则通过氢键相互结合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或 RNA-RNA 双链分子。用带有标记（放射性同位素、荧光染料等）的DNA或RNA片段作为核酸探针,与组织切片或细胞内待测核酸(RNA或DNA)片段进行杂交，然后用相对应的检测方法（放射自显影等）予以显示，在光镜或电镜下观察目的DNA或mRNA的存在，并对其进行准确定位。,一、原位杂交的基本原理,原位杂交组织化学技术在生命科学的研究中可视为一项革命性的技术。它使研究从器官、组织和细胞水平走向分子水平。为各个学科的研究带来突破性的进展。 其中特别突出的是细胞或组织的基因表达、染色体分析

4、、病毒诊断和发育生物学。,根据分析检测对象的不同，分为：菌落原位杂交、组织原位杂交和基因组原位杂交。 1、菌落原位杂交：将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂解以释出DNA或RNA。将DNA或RNA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。,二、原位杂交的分类,2、组织原位杂交：用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。,二、原位杂交的分类,3、基因组原位杂交：基于核酸分子杂交的基本原理，用标记的核酸探针，经过检测系统，对染色体和染色体组整体进行分析检

5、测的一种手段。,二、原位杂交的分类,1、地高辛原位杂交 2、荧光原位杂交（FISH） 3、多色荧光原位杂交 4、比较基因组原位杂交 5、RNA原位杂交,三、发展起的新技术,三、发展起的新技术,1、地高辛原位杂交地高辛是一种类固醇半抗原化合物，化学名为异羟基洋地黄毒苷，地高辛配基标记于脱氧尿嘧啶三磷酸核苷（dUTP）上形成Dig-11-dUTP。通过随机引物法或缺口平移法，将Dig-11-dUTP与探针核酸分子相连制备成标记探针。将其与组织，细胞或染色体原位核酸分子之间的同源序列在一定条件下进行互补杂交，然后用偶联有酶或荧光素的羊抗地高辛抗体Fab结合物作为酶标或荧光标记，再分别用显色底物使杂交

6、部位得以显色或产生荧光以达到检测目的。,1、地高辛原位杂交优点： *对人体无害 *不受半衰期时间的限制，探针可以长期保存 *不受组织、细胞中内源性生物素的干扰 *分辨率和敏感性与同位素标记探针不相上下 *染色鲜艳、反差好 *成本低,三、发展起的新技术,三、发展起的新技术,2、荧光原位杂交(FISH)它是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术,以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。,三、发展起的新技术,2、荧光原位杂交(FISH) 基本原理:将DNA(或RNA)探针用特殊的核苷酸分子标记,然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上

7、,再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维切片上的定性、定位、相对定量分析。,2、荧光原位杂交(FISH) 优点： *安全、快速、灵敏度高 *探针能长期保存 *能同时显示多种颜色 *不但能显示中期分裂相，还能显示间期核 *与局限于活细胞、灵敏度相对较低的传统细胞遗传学技术相比，FISH应用范围广、灵敏度高、可以检出较小片段的变异，能更好地满足临床常规诊断的需求。,三、发展起的新技术,3、多色荧光原位杂交利用FISH可以对不同的靶DNA进行同一标本上的定位，但是不同荧光分子的光谱存在重叠，限制了对不同颜色荧光分子的应用。为了克服这一缺憾，利用比例标

8、记法，使FISH技术从单色发展到多色水平，同一个探针可以同时利用几种不同颜色的荧光分子进行标记组合以产生新的颜色，通过调整各种荧光分子之间的比例来扩展探针标记的容量。,三、发展起的新技术,三、发展起的新技术,通过整条染色体涂染判断易位染色体,三、发展起的新技术,4、比较基因组原位杂交(CGH )利用两种不同的荧光分別标记两种不同細胞的Genomic DNA，再同时与正常的染色体进行杂交，染色体上不同荧光间的强弱对比不同，由此比较而观察基因组中特定基因的拷贝数变化。CGH主要用于检测肿瘤组织DNA拷贝数变化（缺失、复制、扩增），并能将这些异常在染色体上定位。该方法通过同一次实验即可扫描整个肿瘤基

9、因组DNA序列的增加或丢失。,三、发展起的新技术,5、RNA原位杂交用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，可通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物做出定性定量分析。,三、发展起的新技术,四、原位杂交技术的特点,1、能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究2、不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高3、能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态,四、原位杂交技术的特点,四、原位杂交技术的特点,FISH技术在检测不同靶DNA时的分辨率比较,1、菌落原位杂交,五、原位杂交的主要

10、步骤,1、菌落原位杂交,五、原位杂交的主要步骤,将硝酸纤维素滤膜置于含抗生素的平皿琼脂培养基上，用无菌牙签挑取单菌落种于滤膜和主琼脂平板上，排列成方格栅，膜和板上菌落位置相同。 培养细菌至产生1-2mm大小的菌落。 在一块平皿中置4张滤纸，用10%SDS浸透，倒掉多余液体，将带有菌落的滤膜取下轻轻置于滤纸上，菌落面在上，注意防止滤膜底面存有气泡。,1、菌落原位杂交的主要步骤,五、原位杂交的主要步骤,5min后，将滤膜转至用变性溶液（0.5mol/L NaOH,1.5mol/LNaCl）浸湿的滤纸上，放置10min。 将滤膜转至中和溶液（1.5mol/L NaCl, 0.5mol/L Tris-

11、HCl pH8.0)浸湿的滤纸上，放置10min，重复中和一次。 将滤膜移至用2SSPE溶液浸过的滤纸上，放置10min，SSPE配成20贮备液：3.6mol/L NaCl,0.2mol/L NaH2PO4(pH7.4)，20mmol/L EDTANa2（pH7.4)。 将滤膜用滤纸吸干，80真空烘干2h。,1、菌落原位杂交的主要步骤,五、原位杂交的主要步骤,五、原位杂交的主要步骤,2、组织原位杂交的基本步骤材料处理及细胞样品的固定； 样品的制备和预处理； 探针的制备和预杂交； 探针及样品的变性； 杂交温育； 检测杂交信号，进行结果分析。,1.制片 染色体原位杂交要求高质量的细胞学制片，因而需

12、要最好的细胞分裂相。 细胞分裂相应尽可能干净，没有细胞壁和细胞质的干扰。 用RNA酶除去细胞质中的RNA，避免其与探针DNA杂交。 用蛋白酶K酶解以增大材料的渗透性并除去与DNA粘连且抑制探针杂交的蛋白 。,五、原位杂交的主要步骤,2.杂交液的配制 杂交液所含成分除大约2.5 ng/ul的标记探针DNA外，还包括： 50%甲酰胺，是解双螺旋的分子，会破坏氢键的形成，促进DNA和探针变性后，进行杂交； 10%硫酸葡聚糖，形成探针混合液基质，对DNA有浓缩作用，可提高杂交的反应速度10倍以上，但不影响探针的洗脱强度；杂交时常用浓度为5%10%，但浓度高时会使溶液的粘度增大，不利杂交探针的渗透。 0

13、.1SDS,它有助于探针的渗透; 2SSC,作为调节探针洗脱强度的缓冲液; 封阻DNA：浓度通常为探针DNA的1100倍,作用是杂交掉探针中的相似序列，阻止探针DNA与非目标DNA的粘连，即用于阻止探针与非特异位点或非目标DNA杂交。,五、原位杂交的主要步骤,3.变性及杂交 制片DNA一般用70%去离子甲酰胺于70%下变性2分钟即可。杂交探针需于70-90 下变性10分钟。在将探针DNA加到待检测的制片上后需于80-90 下共变性10分钟。 注意：在每次变性后，都需要将样品用冰迅速冷却，以保持变性后单链状态。,杂交一般是在探针温度大约在Tm-25 （基因组原位杂交一般是37）、避光恒温条件下进

14、行，持续时间可以是12-20小时，在此期间，要注意保湿。,五、原位杂交的主要步骤,4.洗脱,洗脱的目的是去掉杂交弱的探针,减少杂交背景,有利于信号的检测。一般用2SSC洗3次,每次510min, 其中第1和第2次用42,第3次用室温洗。在第2次洗的2SSC中含有50%甲酰胺。原位杂交实验最初的洗脱强度应该低一些，有助于探针与目标DNA形成专一性结合。增大洗脱强度可以除去非专一性杂交阻止部分或全部交叉杂交的作用，减少杂交背景，但可能会减少信号的强度。,五、原位杂交的主要步骤,5.检测,（1）利用酶催化显色反应识别 （2）荧光显微镜观察杂交信号,基因组原位杂交大小麦杂交后代中大麦遗传物质的鉴定,五

15、、原位杂交的主要步骤,以特异序列为探针鉴定rDNA在染色体上的分布,5.检测,五、原位杂交的主要步骤,附：染色体核型模式照片和核型图,5.检测,五、原位杂交的主要步骤,附：染色体分带结果,5.检测,五、原位杂交的主要步骤,中期及间期细胞遗传学分析 染色体结构变异鉴定 检测基因扩增和缺失 基因或者特异性DNA序列的定位 染色体RNA和基因组进化的研究,六、在遗传学研究中的应用,例1：检测原癌基因HER-2的扩增 在原发性乳腺癌中有2030的病例会出现人类表皮生长因子受体2（HER2）基因的扩增和蛋白过度表达，HER2过度表达的乳腺癌浸润性强，无病生存短，预后差。另外，HER2 的状态是乳腺癌药物

16、（蒽环类药物和曲妥株单抗）治疗的主要参考指标，其中曲妥珠单抗(赫赛汀)是一种重组DNA衍生的人源化单克隆抗体，选择性地作用于HER2的细胞外部分，适用于治疗HER2过度表达的乳腺癌。由于只有HER2过度表达或HER2基因扩增的乳腺癌患者用赫赛汀治疗才有效，因此检测HER2的状态对于赫赛汀的用药指导非常重要。目前临床上，荧光原位杂交技术被认为是检测HER-2状态的金标准。接受的标本类型：组织切片。,六、在遗传学研究中的应用,六、在遗传学研究中的应用,例2：检测白血病融合基因 白血病是我国高发肿瘤之一。细胞遗传学对肿瘤分型、诊断、治疗和预测预后都具有重要的意义，但常规的细胞遗传学分析方法只能分析中

17、期染色体，对间期细胞、复杂核型细胞和染色体微缺失无法进行诊断。荧光原位杂交技术弥补了传统细胞遗传学在这方面的不足，因此被广泛用于白血病的研究、诊断等方面。,六、在遗传学研究中的应用,例2：检测白血病融合基因 1）白血病BCR/ABL融合基因；CML（慢性粒细胞白血病，Chronic Myelognous Leukemia）是一种发生于造血干细胞的血液系统恶性克隆增生性疾病。90%以上的CML患者血细胞中会出现Ph1染色体，t(9；22)(q34；q11)，也就是9号染色体长臂上C-abl原癌基因易位至22号染色体长臂的断裂点集中区（bcr），形成BCR/ABL融合基因。 2）白血病PML/RARA融合基因；APL（急性早幼粒细胞白血病，Acute Promyelocytic Leukemia）具有特异性的染色体易位t(15；17)，也就是17号染色体上的RARA基因与15号染色体上PML基因融合，产生融合基因PML/RARA。 接受的标本类型：外周血和骨髓。,