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1、生物活性物质分离技术（II）,丁国斌 山西大学生物技术研究所 电话：18135105659 E-mail：,发现青蒿素 屠呦呦获国际医学大奖2011年度拉斯克奖,中国中医科学院授予屠呦呦杰出贡献奖(2011),证明了从传统药物获得确定化学成分药物的价值。,青蒿素（artemisine）是从中药黄花蒿中提取的有过氧基团的倍半萜内酯抗疟新药。青蒿素是中国发现的第一个被国际公认的天然药物，在其基础上合成了多种衍生物，如双氢青蒿素、蒿甲醚、青蒿琥酯等。青蒿素类药物毒性低、抗疟性强，被WTO批准为世界范围内治疗脑型疟疾和恶性疟疾的首选药物。,黄花蒿 (Artemisia annua Linn),1971
2、年首先从黄花蒿中发现抗疟有效提取物,1972年又分离出新型结构的抗疟有效成分青蒿素,1979年获国家发明奖二等奖,2011年9月获得拉斯克临床医学奖,天然产物的活性成分是由复杂的化学物质组成的，一般认为具有药用价值的物质主要有生物碱、萜类、甾体、黄酮类、蒽醌类、苷类、香豆素类、有机酸、单糖、低聚糖、氨基酸、蛋白质、酶等。天然产物的提取、分离就是利用某种介质尽量使需要的成分和不需要的成分分开，即将具有生理活性的有效成分从天然有机化合物中分离的过程。,概述,生物碱（alkaloid）是一类含氮碱基的化合物，能与有机酸反应生成盐类，有类似碱的性质，是天然的含氮有机化合物（蛋白质、肽类、氨基酸及维生素
3、B除外）。生物碱除少数来自动物，如肾上腺素等，大都来自植物，以双子叶植物最多。生物碱存在于植物体的叶、树皮、花朵、茎、种子和果实中，分布不一。,生物碱(alkaloid),喜树碱 Mn: 348.34,10-羟基喜树碱（HCPT） Mn: 364.35,萜类化合物是自然界存在的一类以异戊二烯为结构单元组成的化合物的统称，也称为类异戊二烯。该类化合物在自然界分布广泛、种类繁多，迄今人们已发现近3万种萜类化合物，其中有半数以上是在植物中发现的。,萜类(terpenoids),2-甲基-1,3-丁二烯，异戊二烯,甾体化合物具有一个四环的（A、B、C、D）母核，这个母核像“田”字，并且在C10和C13
4、处各有一个角甲基，在C17处有一侧链，这样在母核上的三个侧链像“巛”字，“甾”字十分形象的表示了这类化合物，是广泛存在于自然界中的一类天然化学成分。,甾体(steroid),甾体母核,黄酮类化合物系色原酮的衍生物。现代黄酮的定义为：凡两个苯环（A环、B环）通过三碳链相互联结而成的一类成分称为黄酮类化合物，绝大多数为黄色。,黄酮类化合物(flavonoids),色原酮,槲皮素,柚皮素,蒽醌类化合物的基本母核为蒽醌，母核上常有羟基、羟甲基、甲基、甲氧基和羧基等取代基。在天然产物中，蒽醌常存在于高等植物的蓼科、豆科、茜草科和低等植物地衣类和菌类的代谢产物中。蒽醌类具有止血、抗菌、泻下、利尿的作用。,
5、蒽醌类化合物(Anthraquinone),1,2-蒽醌,1,4-蒽醌,9,10-蒽醌,在进行植物成分提取分离前，应重视所用植物品种的鉴定、来源和采集季节，并查阅有关文献资料，了解前人对该植物或同属植物中化学成分的分离条件，加以分析，吸取可以借鉴的经验，这会给提取分离工作带来重要的启示。通过化学成分的预试验及探索性实验，再选择设计适当的提取、分离方法，不仅可以保证所需有效化学成分的提出，还可以尽量避免杂质的干扰。,天然产物的提取方法很多，按照形成的先后和应用的普遍程度可以分为经典提取及分离方法和现代提取及分离方法。经典提取及分离方法是指出现时间较早且迄今一直被普遍采用的传统方法，即一般提取分离
6、方法。一般提取分离方法包括溶剂提取法、水蒸气蒸馏法、吸附法、盐析法、透析法、沉淀法、结晶法等，不需要特殊的仪器设备，操作简便易行 。这些传统的提取和分离方法应用广泛、工艺简单、成本低廉，所以至今仍为经典。,经典提取分离方法,1、溶剂提取法,溶剂法是最常用的提取方法，它采用“相似相溶”的原理，一般选用对所需成分溶解度大而对其他成分溶解度小的溶剂将所需成分从植物组织内溶解出来。该法是提取中药有效成分最常用的方法。天然产物的提取、分离就是利用某种介质尽量使需要的成分和不需要的成分分开，即将具有生理活性的有效成分从天然有机化合物中分离的过程。,溶剂的选择,根据天然产物有效成分的结构特点可以选择惰性溶剂
7、和反应溶剂进行提取。惰性溶剂是指水、乙醇等与化合物基本不起化学反应的溶剂，常用甲醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯等有机溶剂；反应溶剂通常是稀酸、稀碱的水溶液或醇溶液等，内酯类化合物通常利用此类溶剂与其它杂质分离。一般来说，天然产物有效成分在溶剂中的溶解度与溶剂的性质有直接关系，同样也与其分子结构有关。适宜溶剂的选择必须符合以下要求：与植物中的化学成分不起化学反应；对所需成分溶解度大而对杂质溶解度小或反之；经济易得，使用安全，可回收，不污染环境；沸点适中，便于回收重复利用。,常见溶剂的极性强弱可根据介电常数大小来判断，介电常数越大，溶剂极性越强。常见溶剂的极性强弱顺序如下：石油醚 二硫化碳 四氯化碳三氯
8、乙烷 苯 二氯甲烷氯仿 乙醚乙酸乙酯丙酮乙醇甲醇 乙腈水 吡啶 乙酸。 强极性溶剂（水）优点：价廉易得，极性强，穿透力强，溶解范围广，如中药中常见的苷类、分子量较小的糖类、氨基酸、蛋白质、生物碱盐类及有机酸盐类等。缺点：进一步分离困难较大（提取液中含有无机盐、蛋白质、糖等较多水溶性杂质），提取液含杂质较多，不宜保存，浓缩困难（水提取液含有皂苷及黏液类成分时会产生泡沫）。,溶剂的极性,亲水性有机溶剂主要是指甲醇、乙醇及丙酮等。其中乙醇最为常用，它可以溶解生物碱及其盐、苷类及苷元、萜类、木质素、挥发油、树脂、色素、有机酸等。优点：既可溶于水，又可以任意比与亲脂性有机溶剂相混溶；用量少，提取时间短，
9、溶出的水溶性杂质少；对亲脂成分溶解度较好；乙醇提取液毒性小、价格便宜，沸点适中，可重复使用，还具有杀菌作用，不易发霉变质；易浓缩保存。缺点：易燃，甲醇毒性大。,溶剂的极性,亲脂性有机溶剂主要有石油醚、己烷、苯、乙醚、氯仿、正丁醇等。优点：选择性强，渗入植物组织能力较弱，不易溶出亲水性杂质。极性小，可用于提取亲脂性成分，如挥发油、油脂、叶绿素、树脂、植物甾醇、内酯、某些生物碱及某些苷元等。提取液含杂质少，易于浓缩。缺点：若植物材料还有较多水分，则难以溶出其有效成分，且其挥发性较大，大多易燃、有毒、价格昂贵。,溶剂的极性,天然产物有效成分的提取效果主要取决于提取试剂、提取方法和提取工艺的选择，原料
10、、温度、时间等也有不同程度的影响。（1）材料 大小、状态（2）提取温度 适宜的温度（3）提取时间 水加热煮沸0.5-2 h，乙醇加热提取1 h。（4）浓度差 搅拌、更换溶剂,影响提取效率的因素,2、水蒸气蒸馏法,水蒸气蒸馏法是将与水不互溶的被蒸馏分在比原沸点低的温度下沸腾，随水蒸气一同蒸馏出来，经冷凝后进行分离的一种方法。只有当被提取物中的挥发性成分不溶或难溶于水，于100 左右时有一定蒸汽压，在沸腾时与水能长期共存且不发生化学变化时，才能采用水蒸气蒸馏法。该法是目前挥发油提取中应用较为普遍的方法之一。,挥发油又称精油，英文为 essential oils，是存在于植物中的一类具有芳香气味、可
11、随水蒸气蒸馏出来而又与水不相混溶的挥发性油状成分的总称。挥发油为一混合物，其组份较为复杂。主要通过水蒸气蒸馏法和压榨法制取精油。挥发油成分中以萜类成分多见，另外，尚含有小分子脂肪族化合物和小分子芳香族化合物。,挥发油,3、分馏法,分馏是一种高级的蒸馏方法，根据天然产物中各有效化学成分的沸点不同，用分馏柱代替普通的蒸馏头，可将液体混合物从低沸点成分到高沸点成分依次进行常压或减压分馏，从而达到分离、精制纯化的目的。分馏法在天然产物提取分离中应用较为广泛。,4、吸附法,固体物质表面或液体表面对气体或液体中溶质的附着现象称为吸附。吸附法的目的，一是吸附色素、鞣质等杂质，二是用氧化铝、氧化镁、酸性白土和
12、活性炭等吸附剂处理样品，吸附所需物质。吸附剂是决定分离效果的首要因素。活性炭常用于食品工业的脱色、脱臭和净化等。硅胶易吸附极性物质，能吸附水分，难吸附非极性物质。分子筛是一种非极性吸附剂，常用于深度干燥。,5、盐析法,盐析法通常是指向水提取液中加入易溶性无机盐至一定浓度或达到饱和状态，降低植物中某些化学成分在水中的溶解度，并以沉淀形式析出或被有机溶剂提取，从而达到与水溶性杂质分离的方法。常用作盐析的无机盐有氯化钠、氯化铵、硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁等。,6、透析法,利用提取液中小分子或离子易通过半透膜、大分子物质不能通过半透膜的性质，进行分离、精制的方法，称为透析法。透析法常用于分离、纯化皂苷、多
13、糖、蛋白质和多肽等化合物，并且可以除去其中的无机盐、单糖、双糖等。反之，也可以将大分子的杂质留在半透膜内，而小分子物质透过半透膜进入膜外溶液，从而加以分离。,7、升华法,固体物质在受热时不经过熔融直接转化为蒸气，蒸气遇冷后又凝结成固体的现象叫做升华。植物中凡具有升华性质的化合物均可用此法进行纯化。中药中有一些成分具有升华的性质，能利用升华法直接从中药中提取出来。如樟木中的樟脑、茶叶中的咖啡因及植物材料中的苯甲酸等。此法操作简便，但因为直接用火加热易焦化，常伴有分解现象，提取不完全，产率低，很少用于大规模制备。,8、萃取法,萃取法是用来提取或纯化有机化合物的常用方法之一。利用物质在不同溶剂中的溶
14、解度不同（在萃取剂中的溶解度远大于在原溶剂中的溶解度），把固体或液体混合物提取分离的操作方法叫做萃取。萃取法可以分为液-液萃取、固-液萃取。萃取剂的选择对萃取效果影响很大，主要依据为“相似相溶”原理。若有效成分是亲脂性物质，可用石油醚、苯等有机溶剂萃取偏于亲水性的物质，在亲脂性溶剂中难溶，多用乙酸乙酯、丁醇、戊醇等弱亲脂性溶剂作为萃取剂。,9、沉淀法,在样品溶液中加入某些溶剂或沉淀剂，通过化学反应或改变溶液的pH值、温度等条件，使某些天然产物有效成分以沉淀形式被分离的方法叫做沉淀法。根据沉淀剂和沉淀条件的不同，沉淀法主要分为两类：溶剂沉淀和沉淀剂沉淀。沉淀反应是可逆的，能否使有效成分从溶液中析
15、出，主要取决于被分离物质的溶解度。沉淀剂需根据天然产物有效成分的结构特点来选择。铅盐沉淀法是经典的分离、提纯方法之一。常用醋酸铅、碱式醋酸铅等作为沉淀剂，利用中性醋酸铅和碱式醋酸铅在水及醇溶液中能与多种天然产物成分生成难溶的铅盐或络盐沉淀而与其他成分分离。,10、结晶法,通过溶解、除杂、静置等操作，析出结晶物质的过程称为结晶。大多数天然化学成分达到一定浓度时，选择合适的溶剂都能结晶。根据其溶解度的不同，利用反复结晶的方法，从不纯的晶体中制得纯度高、晶形好的结晶物的过程称为重结晶。纯化合物的结晶有一定的熔点和结晶学特征，有利于化合物性质的判断。利用结晶法提纯化合物的关键在于溶剂及温度等结晶条件的
16、选择。,色谱法又叫色层法，旧称层析法，是分离、提纯和鉴定有机化合物的重要方法之一。俄国植物学家茨维特色谱法是利用不同物质在固定相和流动相中不同的分配系数进行分离的一种方法。根据分离时流动相所处的状态，可分为液相色谱和气相色谱。按其分离原理分类，有吸附色谱（利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异达到分离目的）、分配色谱（利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同而分离）、排阻色谱（利用分子大小不同而阻滞作用不同进行分离）、离子交换色谱（利用不同组分对离子交换剂亲和力不同进行分离）等。,色谱分离方法,分配系数：指一定温度下，处于平衡状态时，组分在固定相中的浓度和在流动相中的浓度之比，以K表示。,1、硅胶色谱,硅胶是最常用的吸附剂之一，适用范围广，既能用于极性化合物，也能用于非极性化合物。硅胶属于多孔性物质，可用通式SiO2xH2O表示。硅胶色谱法的原理是根据被分离物质在硅胶上的吸附力的不同而得到分离，一般情况下极性较大的物质容易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，整个色谱分离过程就是吸附、解吸、再吸附、再解吸的过程。流动相的选择：被分离物质和流动相之间的极性关系应符合“相似相溶原理”。,
