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1、1,结核分枝杆菌的试验室诊断,安徽省立医院检验科 马筱玲,2,结核疫情及诊断进展,3,黛玉脸色苍白， 瘦骨嶙峋，经不断 咳嗽及吐血后，香消玉殒，结束了一场哀怨凄绝的爱情故事。,4,我国结核病疫情,全球结核病第二高负担国家，结核病疫情表现有“六多” 。 一、感染人数多5.5亿人感染过结核菌，约占全国人口的45，高于全球平均水平。 二、患病人数多活动性肺结核、传染性肺结核患病率分别为367/10万和122/10万， 三、新发患者多全国每年新发活动性肺结核患者145万， 其中传染性 肺结核患者65万。 四、死亡人数多全国每年约有13万人死于结核病。 五、农村患者多全国约有80的结核病人集中在农村，主
2、要在经济不发达的中西部地 区。 六、耐药患者多全国结核病耐药率高达28。,5,结核病实验室 诊断方法介绍,6,概 述,结核病人的细菌学检查不仅是发现传染源的主要途径和手段，也是结核病确诊和制订抗痨方案，考核疗效、评价治疗效果的可靠标准。 由于结核菌的遗传特性决定其生长周期长，致使常规细菌学检查方法存在着灵敏度低、操作复杂，需时间较长和影响因素较多，不易标准化等缺陷，使细菌学诊断发展缓慢，无法充分满足临床诊断的需要。,7,实验室诊断方法,病原学诊断 辅助诊断,8,病原学诊断,一、涂片抗酸染色镜检法， 二、液基夹层杯结核杆菌检验 三、荧光染色法 四、培养法 五、液体培养显微镜观察药敏试验 六、快速
3、培养检测法， 七、色谱法 八、分子生物学法 九、噬菌体生物扩增法,9,一、涂片抗酸染色镜检法：,国内大多采用厚涂片，比薄涂片法可提高阳性率；涂片萎尼抗酸染色法能保存较久，可备复查； 因费时、繁琐，综合医疗单位常因重视不够，致涂阳检出率低于5%，专业机构涂阳率可达到30%。 国外痰涂片阳性率可达30%40%，反复多次查，可增加到65%75%；,10,涂片优点：简便、快速、价廉,11,涂片的缺点,敏感性低：500010000条菌ml 特异性差：所有分枝杆菌均可着色 无法区别死菌与活菌：结果均为阳性,12,痰菌假阴性原因,病变是封闭或开放； 病变性质和其中能够排出的菌量和排出时间间歇； 结核分枝杆菌
4、形态多样性；,13,二、液基夹层杯结核杆菌检验工作原理,将经过消化灭活处理液处理的痰液、或其他体液标本混悬液置于具有符合光学要求基片的夹层杯中，经过专业离心机离心将混悬液中细菌或细胞牢固附着基片上，并在夹层杯中直接染色后取出基片在载波片上封片，置显微镜下观察。,14,优点： 1、操作方便，易于掌握。 2、片中结核菌分布均匀，染色效果清晰 3、液基结核菌制片技术较离心浓缩集菌法有显著提高： 该方法将所有消化后标本的抗酸杆菌均完整地保留于液基薄片中，从而显著提高了检出率。 4、安全性有所提高： 消化，制片，烤片，染色均在彭氏杯中完成，操作人员不直接接触标本。 采用结核专用消化液，可有效杀灭结核分支
5、杆菌，更好的提高了操作的安全性。,15,三、荧光染色法：,是涂片法中阳性率较高，较快速的方法， 集菌与荧光染色相结合，则荧光显微镜下的抗酸杆菌阳性率可达50%， 荧光法的缺点：假阳性率较高，保存时间短，不到4个月,16,四、培养法,一般都用改良罗氏固体培养基 接种后第3第7天观察，以后每周观察一次菌落生长情况，第8周若仍无生长，报告为阴性。 优点：准确，灵敏度略高于涂片法；可以鉴定死菌与活菌；可进一步进行菌种鉴定和药敏试验. 缺点：诊断周期长，最快也需要6周。 有一定的污染率,17,18,培养假阴性的原因,个别细菌营养要求的特异性； 细菌和细菌营养代谢异质性； 细菌培养前处理对细菌活性影响；,
6、19,分枝杆菌药物敏感性试验,绝对浓度法检测分枝杆菌药敏实验是采用含药罗氏培养基进行的。常用药物终浓度（g/ml）_表 1 绝对浓度法含药培养基中的药物终浓度_ 药 物 浓 度（g/ml） 低浓度 高浓度 异烟肼 1g/ml 10g/ml 利福平 1g/ml 10g/ml 链霉素 10g/ml 100g/ml 乙胺丁醇 5g/ml 50g/ml 对氨基水杨酸 1g/ml 10g/ml 氨硫脲 10g/ml 100g/ml 乙硫异烟胺 25g/ml 100g/ml 卡那霉素 10g/ml 100g/ml 卷曲霉素 10g/ml 100g/ml紫霉素 10g/ml 100g/ml 氧氟沙星 5g/
7、ml 50g/ml 左氧氟沙星 5g/ml 50g/ml 环丙沙星 5g/ml 50g/ml 司帕沙星 5g/ml 50g/ml 力克肺疾 1g/ml 10g/ml 丁胺卡那 10g/ml 100g/ml,20,检测方法,1菌悬液的制备2.接种及培养 3.结果判定与报告 敏感（一）： 含药培养基上无菌落生长。报告菌落数：当含药培养基上菌落数在20个以下时，报告菌落个数。 耐药（1+）： 含药培养基上菌落数约占斜面面积1/4； 耐药（2+）： 含药培养基上菌落数约占斜面面积1/2； 耐药（3+）： 含药培养基上菌落数约占斜面面积3/4； 耐药 (4+)： 含药培养基上菌落呈菌苔样生长。,21,本
8、法弊端,操作繁琐 需时久，4周 结果准确性差,22,五、液体培养 显微镜观察药敏试验,是2000年建立的一种痰标本液体培养结合显微镜观察技术。其原理是MTB含有索状因子，因此其在液体培养基中生长时分泌索状因子，形成索状特征性结构，利用倒置显微镜观察索状结构可用于MTB的快速诊断。由于液体培养基营养丰富，因此MTB生长迅速，使MTB的培养时间显著缩短，培养阳性率显著增加。该法还能在培养的同时直接进行临床标本的直接药敏试验，因此能显著缩短从临床标本到耐药性测定的所需时间，这是其它传统方法所不具有的，也是MODS的最大优点。,23,液体培养 + 显微镜观察,24,结 论,本试剂检测简便，快速，3天就
9、可获得多耐药结核杆菌的检测结果，同时具有较高的敏感性和特异性，与常规方法符合率较高，可用于多耐药结核病的快速检测。 痰标本直接药敏试验比常规方法提早68周，更具有快速诊断价值。 本试剂费用低廉，不需特殊仪器设备，适合基层推广应用。 本法安全、对预防耐药结核病的流行与传播、防止实验室工作人员的感染具有重要意义。,25,六、快速培养检测法,1. BD BACTEC MGIT 960培养系统 2. BacT ALERT 3D培养系统,26,1. BD BACTEC MGIT 960 培养系统,基本原理培养瓶底部含有包被于树脂上的荧光显示剂，由于该显示剂为氧抑制性，当分支杆菌生长使氧消耗后，荧光显示剂
10、被激活，而发出荧光。检测仪测试荧光强度，并判定结果。 优点：快速 7-14天培养阳性 简便 比常规法操作简便， 培养阳性率高于L-J法 缺点：无法观察菌落形态，污染率略高于L-J法，产品依赖进口，价格较贵,27,2BacT ALERT 3D培养系统,原理：该系统采用产色检测技术检测培养系统中分支杆菌生长情况。因其所用的培养瓶底部有颜色感应器，当培养瓶中有细菌生长，C02产生、pH下降时，颜色感应器由绿色变成黄色。仪器自动连续检测，检测的数据输入计算机，根据计算结果自动显示培养瓶中有无分支杆菌生长。 优点：快速 7-14天培养阳性 简便 比常规法操作简便， 培养阳性率高于L-J法 缺点：无法观察
11、菌落形态，污染率略高于L-J法，产品依赖进口，价格较贵。,28,七、色谱法,分为气相色谱(GC)、气液相色谱、高效液相色谱(HPLC)等 GC等能检测分枝杆菌代谢过程中的挥发性物质如脂肪酸所产生的CO2含量，出现不同的色谱峰，从而可鉴定结核杆菌和大部分NTM菌种，且可测药敏。 优点：简单、快速、定量、重复性好，GC与质谱(MS)联用更好； 缺点：仪器昂贵，维护不易，无法普及。,29,八、分子生物学法,利用分子生物学检测方法来检测结核杆菌特异性基因片断，从而为结核病的快速诊断提供依据。 1、聚合酶链反应(PCR)： 2、核酸探针(DNA-probe) 3、染色体核酸指纹法： 4、16s23srD
12、NA(rRNA)序列法 5、耐药基因的检则： 6、其它分子生物学方法,30,1、聚合酶链反应(PCR)：,PCR能快速扩增结核分枝杆菌DNA， PCR检测假阳性和假阴性问题是影响其应用的关键问题。 对于存在的问题对策如下： 扩增产物特异性鉴定探针杂交 高质量试剂（建立国家级检定考评） 规范化操作（培训操作人员） 质量控制 （标准实验室）,31,2、核酸探针(DNA-probe),DNA探针是一小段带标记而能识别特异性核苷酸序列的单链分子。,3、染色体核酸指纹法：,有多种方法， 如限制性内切酶图谱(REA)和限制性酶切片段长度多态性(RFLP)分析等， RFLP用于菌株菌种鉴定和流行病学调查研究
13、。,32,4、16s23srDNA(rRNA)序列法,用于分枝杆菌的菌种鉴定，差不多所有种的分枝杆菌都可鉴定出来。,5、耐药基因的检则：,已查出的结核杆菌耐药基因有rpoB(对利福平)，Kat、inhA、ahpC(对异烟肼)，embl(对乙胺丁醇)，rpsL、rrs(对链霉素)，pncA(对吡嗪酰胺)和gyrA(对氟喹诺酮类，gyrB则为低度耐药)等。,33,九、噬菌体生物扩增法（PhaB）,该法1997建立，并用于结核 分枝杆菌耐药性测定。近年来 进展很快。,34,检测原理,分枝杆菌噬菌体能感染活的分枝杆菌，并在菌体内增殖，裂解菌体，释放出的子代噬菌体，即可感染随后加入的指示细胞（也是一种分
14、枝杆菌），并使指示细胞裂解，在培养皿上出现噬菌斑。若先将待检菌株与某种药物作用一段时间后在加噬菌体检测，并以不加药管为对照，根据含药管和不含药管出现的噬菌斑情况即可判断细菌的耐药性。,35,噬菌体,病毒,只能在活的易感細胞內生長 溶原性感染和溶菌性感染,36,M.tuberculosis cell,特异性噬菌体识别MTB,并与之结合,37,噬菌体DNA进入MTB细胞,并在其内扩增;同时生产蛋白外壳,开始产生新的病毒颗粒,DNA,38,添加特异性杀病毒剂去除所有MTB胞外的噬菌体,胞内噬菌体不受损伤。,39,终止杀病毒反应，添加非致病性，快生长分枝杆菌（敏感细胞）,40,结核分枝杆菌破裂，释放噬
15、菌体。,41,MTB细胞周围的敏感细胞，并在其胞内增殖,42,经过多个“感染增殖细胞消融”循环，在琼脂培养基中的菌苔上形成肉眼可见，清晰的噬菌斑,43,44,杀病毒剂杀灭未感染MTB的噬菌体,MTB裂解, 释放出来的噬菌体感染敏感细胞,噬菌体感染结核分枝杆菌,产生噬菌斑,先以特异性噬菌体感染、裂解标本中的结核分枝杆菌，再用杀病毒剂清除所有未感染MTB的噬菌体，而结核分枝杆菌胞内的噬菌体继续扩增，进而裂解细胞，释放噬菌体。裂解释放的噬菌体感染随即添加的敏感细胞，在其胞内扩增并裂解敏感细胞，敏感细胞菌苔上肉眼可见的噬菌斑。如待检标本不含结核分枝杆菌，噬菌体被杀病毒剂完全清除，故无噬菌体感染敏感细胞，敏感细胞菌苔上无噬菌斑出现。,45,质控阳性对照 20个噬菌斑阴性对照 10个噬菌斑,结果判断标准,标本阳性结果 20个噬菌斑阴性结果 19个噬菌斑,
