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1、肿瘤基因及其调控机制,第一节 癌基因 一、癌基因的基本概念,逆转录病毒的研究对于阐明人类癌症的发生机理具有重要意义。逆转录病毒的基因组中除了病毒本身复制所必需的基因，如编码病毒核心蛋白（gag）、外壳糖蛋白（env）及逆转录酶（pol）等的基因外，还包括一个能引起细胞恶性转化的基因。这种基因就是现在为人们所熟知的癌基因（oncogene，onc）。,由于最初是在病毒中发现的，所以称之为病毒癌基因（v-onc）。后来发现，在许多动物的正常细胞中都存在着与 v-onc 相对应的DNA序列，称之为原癌基因（protooncogene）或细胞癌基因（c-onc),现有资料表明：细胞癌基因与病毒癌基因基
2、本上是同源的，但用DNA测序技术可查明，在二者之间可以有一个或几个碱基对的差别。所以现在认为，细胞癌基因是病毒癌基因的前体，而病毒癌基因则是细胞癌基因的转导翻版；,细胞癌基因在长期进化过程中极为保守，在无脊椎动物（如果蝇）的基因组中就可以找到与哺乳动物细胞癌基因基本上同源的序列。所以实际上在正常情况下，细胞癌基因不仅对机体无害，而且可能在发育过程中，以至于对生命的维持起着重大的作用：,细胞癌基因在正常细胞中可以有低水平的表达，而在癌组织中与其相对应的活化癌基因的表达水平却比它高的多。,二、癌基因的分类,较早期的分类是根据癌基因的产物在细胞内的定位，将其区分为胞质癌基因和核癌基因两大类。随着癌基
3、因数量的增加，这一分类显得不够完善。近年来，人们趋向于用癌基因蛋白的结构与功能及其在细胞内的定位来进行分类。,按照这一原则癌基因可分为五大类：生长因子类酪氨酸激酶类丝氨酸苏氨酸激酶类GTP结合蛋白（ G蛋白）类核结合蛋白类,Demezuk （1991）对癌基因作了全面的综述，列出了87种癌基因，并进行了分类。鉴于近年来又有一些新的癌基因和抑癌基因出现，对此作了一些增补。现以其资料为基础，对五举癌基因分别介绍如下：,1. 生长因子类：属于这异类的有sis,int-2等五个癌基因。 特点是其产物与某些生长因子极为相似：例如，猴肉瘤病毒v-sis癌基因的蛋白产物p28与血小板生长因子（PDGF）链几
4、乎完全相同。因此sis蛋白可模拟PDGF同其受体结合，刺激细胞过度增殖。,受病毒感染的细胞可向周围分泌生长因子，后者又反过来向分泌它的细胞连续发放增殖信号，最终导致细胞癌变。这种癌变过程中的独特现象称为“自分泌”（autocrine)。小鼠乳腺瘤病毒（MMLV）的int-2癌基因产物gp27-34类似于成纤维细胞生长因子（FGF），其过度表达可诱发小鼠乳腺新月形癌。,2.酪氨酸激酶类：属于这一类的癌基因较多，现在较明确的有21 种。根据其功能的差别，还可分成两个亚类：细胞表面生长因子受体膜结合的酪氨酸激酶,细胞表面生长因子受体：包括erbB-l，erbB-2/HER/neu等7个癌基因。禽成红
5、细胞瘤（AEV）病毒癌基因erbB-l的蛋白产物pl70与上皮细胞生长因子受体（EGFR）的氨基酸序列高度同源。因此，它可模拟EGFR进行工作。即使在没有外源性刺激时，也能不断地使胞内靶蛋白发生酪氨酸激酶反应，从而连续地向细胞核发放增殖信号，导致细胞过度增殖。,ErbB-2的蛋白产物pl85也与EGFR类似。猫肉瘤病毒癌基因fims的蛋白产物gp105165则与集落刺激因子（CSF-l）受体相似。,膜结合的酪氨酸激酶：包括src-l，abl等14个癌基因。Rous肉瘤病毒（RSV）癌基因src-l的蛋白产物 pp60是第一个被人们分离，并研究得最多的癌蛋白，分子量为 60 kD，长 526个氨
6、基酸残基，分布在质膜内侧。pp60是专一地使蛋白质分于中的酪氨酸残基发生磷酸化的蛋白激酶，称为酪氨酸专一性蛋白激酶（用P-tyr表示）。,在正常细胞中，P-tyr仅占总蛋白磷酸化的13000（其余由丝氨酸专一性蛋白激酶磷酸化，占90，还有10由苏氨酸专一性蛋白激酶磷酸化），而在被RSV转化的细胞中，P-tyr升高了 10倍。本亚类中其他癌基因的产物也具有 P-tyr活性。前述的 erbB- l等生长因于受体均具有P-tyr活性，因而推测本亚类癌基因也可能参与细胞生长的调控。,已知有一种含酪氨酸的粘着斑蛋白（vinculin）是 pp60 P-tyr蛋白激酶的底物之一。它位于质膜内侧的吸附斑中，
7、而组成细胞骨架微丝结构的肌动蛋白束正好固定在吸附斑上。在正常细胞中，粘着斑蛋白的磷酸化仅占该蛋白磷酸化的1，而在转化的细胞中则上升至20 。同时发现在RSV转化细胞株中吸附斑大量减少，其肌动蛋白束的结构遭到严重破坏。,Pp60 P-tyr的另一种与细胞骨架有关的靶蛋白是p36，它结合在含有微管蛋白，肌动蛋白和肌球蛋白的细胞骨架上，它的酪氨酸被 pp60 P-tyr磷酸化后也可导致细胞骨架破坏。由此可见，RSV病毒转化的细胞中src癌基因的过度表达，是导致细胞骨架微丝、微管系统破坏的重要原因。,3.丝氨酸苏氨酸激酶类：关于这类癌基因只列举了raf-1,mos和pim-1三种，它们的蛋白产物都是定
8、位于胞质的丝氨酸苏氨酸专一蛋白激酶，与第二信使CAMP调节系统有密切关系。已知有一种CAMP依赖性蛋白激酶就是丝氨酸专一性蛋白激酶，具有传递CAMP的信号及调节基因表达的作用。,4 . GTP结合蛋白类 此类包括ras族的H-ras，K-ras，N-ras三个癌基因，以及在垂体及卵巢肿瘤中发现的gsp癌基因。 ras族癌基因是目前研究得最多的癌基因。从人体肿瘤分离到的活化癌基因都属于ras族，其基因产物p21ras蛋白的分子量约21kD，长188189个氨基酸残基，分布于质膜内侧。具有GTP依赖的GTPase活性，其一级结构和生化特性和“G蛋白”十分相似。,G蛋白是媒介多肽激素受体的信号与细胞
9、内效应器腺苷环化酶之间的偶联因子，通过激活或抑制腺苷环化酶的活性直接或间接地调节cAMP的浓度，进而调控细胞的生长。ras族原癌基因可能象G蛋白一样参加腺苷环化酶信号系统的调控。ras族癌基因在12，13或61位氨基酸残基的点突变将使 p21ras失去水解的活性，并使细胞过度增殖。,5.核蛋白类：属于这一举的癌基因有myc,myb,fos等12个。 其中研究得最为详尽的是 c-myc。c-myc最早发现于禽粒细胞瘤病毒（ AMV）中，并广泛分布于从酵母到人的基因组中。它含有 3个外显子，编码一种含439个氨基酸，分子量为62kD的蛋白质。该蛋白定位于细胞核内，属DNA结合蛋白，可同单链或双链D
10、NA结合。,c-myc 的表达具有组织专一性，细胞周期特异性和发育阶段特异性。在正常组织中 c-myc 可有低水平表达，而在大多数实体肿瘤中，其表达明显增高。在癌前病变和一些良性肿瘤中，也可见到表达增高。一般认为， c-myc 的扩增是导致原癌基因活化的主要途径。,以上资料表明，c-myc蛋白可能是一种调控细胞增值和分化的调控蛋白，它可以识别和结合到基因组中特定的识别序列，并活化那些与细胞增殖和分化有关的基因。c-myb 也有类似性质，主要在造血细胞分化的某些特定阶段表达，而在一些造血系统肿瘤中其表达可增高。,近年来陆续发现了一些新的癌基因，它们在癌变过程中起着重要的作用： int-2 jun
11、 met PCNA Ki-67核抗原 mdm2, int-2 定位于 7q31，编码分子量为 27kD的蛋白，该蛋白的部分结构与成纤维细胞生长因子具有同源性。它具有刺激表皮细胞生长的作用，但需要与其他基因协同才能完成细胞的恶性转化。Int-2基因的扩增率在乳腺癌中达19，但扩增的倍数不高。一般认为，该基因的高表达与肿瘤的转移，复发和预后不良有关。, jun 定位于lp3132，编码分子量39kD的蛋白。蛋白定位于核内。Jun与随后发现的junB，junD都是核转录因子，与c-fos形成转录调节复合物，其蛋白产物FOSJun能与其他反式因子如视甲醛受体（RAR）、糖皮质激素等相互竞争，对转录起调
12、节作用。, met 定位于7p31，其转录产物有多种，分别为9.0,7.0,6.0,5.0和3.2kb mRNA。蛋白产物主要有两种，分别为 ppl40-145met肝细胞生长因子受体和 pp65tpr-met活化融合蛋白。最初确定其为转化基因是在以MNNG处理的人骨肉瘤细胞系中，由于l号染色体的tpr序列插入到7号染色体的 met基因形成tpr-met重排而使其活化。,其主要功能为促进肝细胞生长及诱发细胞转化。 c-met基因的活化与多种肿瘤的发生有关，其活化机理主要为扩增和重排。现已证明，9.0 kb c-met mRNA及其蛋白产物在胃癌和肝癌等肿瘤中的表达高出正常组织许多倍，而且表达程
13、度与预后有关。, PCNA 增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）是一种在细胞增殖周期中合成和表达的36kD蛋白质，主要在G1后期及S早期在核仁中合成并在细胞核内聚集，因此进入细胞周期的正常细胞和肿瘤细胞都含有PCNA。采用PCNA单抗定位研究PCNA，可以作为判断细胞增殖情况和预后的一种手段。, Ki-67核抗原 Ki-67存在于增殖细胞核内，在G1中期开始表达， S期和 G2期增多， M期达到高峰，G0期细胞阴性，因此Ki-67在调节细胞增殖中起重要作用。用免疫组化法证明，癌组织中阳性细胞数明显高于正常细胞和良性肿瘤，因此对鉴别良恶
14、性病变有一定实际意义。Ki-67表达水平的高低与肿瘤预后之间也有密切关系。, mdm2 mdm2基因最初是从一个含有双微体（ DM）的自发转化的 BALB3T3细胞系中克隆出来的一个高度扩增的基因，定位于12ql314上，该基因全长由2372个碱基对组成，编码区全长1473个碱基，编码一个长度为491个氨基酸践基的蛋白质，分子量为90kD。,动物实验己证明，mdm2可使细胞转化并具有成瘤性。在某些恶性软组织肿瘤，骨和脑肿瘤中发现了mdm2扩增，说明其可能与这些肿瘤的发生有关。 mdm2癌基因不仅可通过扩增而直接致癌，而且可作用于抑癌基因p53使正常的p53失活而间接致癌。,三 、癌基因的活化机
15、理,细胞癌基因存在于正常细胞中，但在正常情况下并不表现出致癌性，只有在各种外因和内因作用下使细胞癌基因活化，才能导致肿瘤发生，癌基因活化的机理可能多种多样的，但主要的有以下6种：,1. 转导（ transduction）2. 点突变（point mutation）3. 插入突变（insertional mutation)4. 易位(translocation)5基因扩增（ gene amplification） 6. 基因甲基化的改变,1. 转导（ transduction） 在漫长的生物进化过程中，现在的逆转录病毒的祖先在感染正常细胞的同时，通过复杂的遗传学重组和突变，将正常细胞的细胞癌基因
16、整合到其基因组中，并使之改变成活化的病毒癌基因。带有病毒癌基因的逆转录病毒在感染适当的动物时，可使之发生肿瘤。,2. 点突变（point mutation） 美国的 Weinberg，Wigler和 Cooper等实验室于 1983年分别从不同的膀胱癌细胞系中分离DNA，用以转染NIH3T3细胞系，可使之发生恶性转化。从转化细胞中已分离到活化癌基因的分子克隆，并证明其与Harvey鼠肉瘤病毒的癌基因（v-Ha-ras）非常相似。,在人类正常细胞中也发现了其对应物(c-Ha-ras), Barbacid与Weinberg的研究组分别发现，膀胱癌中的活化癌基因与其对应的正常癌基因之间只有一个碱基对的差别，即(c-Ha-ras)基因的第一个外显子(exon)所编码的多肽链氨基端第 12位密码子上发生了有突变，其鸟瞟呤被胸腺嘧啶所取代，使其编码的甘氨酸被氨酸所取代。这一单个碱基对的点突变，看来就是正常细胞癌基因变成活化癌基因的关键。,
