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1、,干细胞产品技术服务,OricellTM,OricellTM,最新产品：,1. ES成神经元分化试剂盒； 2. ES成心肌分化试剂盒；,3. ES成肝实质细胞分化试剂盒； 4. MSC成肝实质细胞分化试剂盒； 5. NSC成神经元分化试剂盒；,6. NSC成星型胶质细胞分化试剂盒；,目录：,胚胎干细胞培养和技术介绍,成体干细胞的常见问题与解决方案,1.细胞和培养（干细胞、原代细胞产品和试剂） 2.细胞分化（多个方向的标准方法） 3.细胞示踪（GFP/RFP 和定制方法）,干细胞冻存和复苏方案干细胞应用技术,Stem cell,间充质干细胞（MSC）,Mesenchymal Stem Cells
2、是一种多能干细,胞；,胚胎干细胞（ES）,Embryonic Stem Cells是一种全能的干细,胞,神经干细胞（NSC）,Neural Stem cell是一种神经系统的多能干,细胞,Primary cell,神经元系统（多个来源和物种，海马、皮层）星型胶质细胞（多个物种皮层）肝实质细胞；,肝脏前体细胞；,分离其他客户定制细胞；,胚胎干细胞,胚胎干细胞,胚胎干细胞(embryonicstemcellES, 细胞) 是指胚泡期的内细胞团中分离出的尚未分化的、 能在体外培养、具有发育全能性的早期胚胎细胞无限增殖、自我更新,可分化为三个胚层来源的各种组织及细胞类型,ES细胞的来源：5d 胚胎,A
3、BC D,ES生长特性,鼠：生长快，胰酶消化，2天传一次，可一传多。,复苏率较高。,人：生长慢，机械分离，710天传一次，相,对较少。1:41:6。,复苏率低。,表面抗原的表达,Oct-4：一种转录因子，发育全能性的标志。,碱性磷酸酶（AKP）：常被用来作为鉴定ES,细胞及其分化与否的重要标志。,SSEA-1：小鼠ES表达,SSEA-3、SSEA-4：人ES表达,染色体结构,核型分析：正常稳定的二倍体核型。不随传代次数而改变。,46，XX；46，XY,核型检测：46，XX,多能性和全能性体内：畸胎瘤实验特定抗,拟胚体,特定条件诱 体免疫 导/自然分化 组化,体外分化,去除饲养层细胞,全能性,体
4、内：畸胎瘤实验,体外：去除饲养层细胞,拟胚体（EB, embryoid body。为ES 细胞悬浮,生长自发分化形成,含有内中外三个胚层组织,能基 本上模拟体内的发育过程) ；贴壁诱导；,特定条件诱导/自然分化（除去LIF）各胚层特定抗体免疫组化检测,体内：畸胎瘤检测,血管组织呼吸道上皮,鳞状上皮,腺体组织脂肪组织,体内分化,外胚层：鳞状上皮、神经组织等,中胚层：骨和软骨、横纹肌、骨骼肌、血细胞和骨髓细胞等 内胚层：柱状上皮、肠管样组织等,体外：分化形态,ES贴壁诱导,EB约57天后出现自主性搏动,129 Mouse,Human ES,免疫组化检测,Nestin (ectoderm )Trop
5、onin (mesoderm ),Tubulin (ectoderm )AFP (endoderm),神经分化：贴壁诱导第2天,神经分化：贴壁诱导第5天,IHC 3 Tublin,特异性抗原的表达情况,抗原人ES鼠ES,Oct-4+,Nanog+,SSEA-1+,SSEA-3+,SSEA-4+,不断有新的蛋白标记被发现和论证,碱性磷酸酶染色,小鼠ES流式图,染色体结构,核型分析：正常稳定的二倍体核型。不随传代次数而改变。,人（46，XX），鼠（40，XY),性别分析,性别通过PCR的方法鉴定，目的基因是基因组,DNA的Y染色体相关基因Tspy，阳性对照用X,染色体相关基因PolA1以及Gapd
6、h 。,ES Clone,mES-GFP,Human ES-GFP,MEF 细胞：ES成功的一个重要因素,Cyagen提供的MEF经过-irradiation 处理，,确保所有的细胞都完全失去增殖能力，又可以保 证最佳支持和分泌能力，同时没有任何化学有毒 物质的污染，为你ES细胞提供最佳的生长环境；为ES的增殖提供多种因子；,实验室的调查普遍结果：,据Cyagen 对多个实验室使用的53个ES细胞,的样品进行检测，45%被支原体污染；,没有严格质量控制和环境控制的情况下制作的,MEF：有35%以上是携带支原体，这个数据,还根据操作技术不成熟，使用动物污染严重情况， 风险也会大大的增加；,丝裂霉
7、素C（MITOMYCIN C）：,A、长期接触丝裂霉素C，药物毒性将严重影响操作人 员的身体健康；（单位量1030ug/ml处理20个10cm dish 需要36mg）,B、丝裂霉素C溶液的不稳定，4保存，也会快速降解， 导致处理的细胞不能完全失活，这将严重影响后面实验 分析；,C、丝裂霉素C的残留，微量的丝裂霉素C也会造成ES细 胞增殖抑制和分化；（因为其是细胞内DNA结合剂）,OCT-4 (+)SSEA-1 (-)SSEA-4 (+),AAA,BBB,CCC,Es细胞培养的过程：,如何准备状态良好的MEF细胞；消化传代过程；,如何去除MEF细胞；挑克隆的操作；,如何准备用于进行各种基因操作
8、的细胞；如何准备用于进行注射的细胞；,如何准备状态良好的MEF细胞；,取胚胎（13.5d）：去除头部和四肢；,剪碎后加入0.125%胰酶进行消化到组织块基 本消失；,终止消化并离心收集细胞；（检测细胞支原体）重悬接种：5000-10000cells/cm2第二天换液后培养3天，进行-射线照射；冻存检测；,生产过程控制：,动物：胚胎的孕龄；动物的污染物；细胞的支原体；,细胞的支持能力；细胞的失活；,蛋白表达检测；,合适的MEF的密度：,细胞的贴壁效率；细胞的分泌能力；细胞的大小；,最佳的密度受到很多因素影响：25000cells,过密：克隆生长缓慢，克隆小，但是立体感好；过稀：克隆容易分化，边缘
9、不清晰，但是克隆增 殖稍快；,最佳的密度：克隆边缘清晰，细胞容易增殖，大 小均一。,如何去除MEF：,无饲养层培养：但是代数非常有限，基本不能长 期传代；,MEF培养：可以长期培养，细胞的状态好，不,影响细胞的全能性；,原理：利用不同细胞的贴壁的时间差异；,步骤：消化后离心重悬，在包被明胶的皿上贴壁,30min，轻轻吸出上清，接入另外一个包被有,明胶的皿中30min，再吸出上清中的细胞；并 在包被的皿上培养一段时间，就可以去除大部分 的MEF细胞；,影响因素：,克隆的状态：分化的细胞的贴壁性会大大增加；,MEF的状态：MEF如果有大量的碎片也会增加,液体的粘稠度干扰细胞的正常分离；,消化的效果
10、：如果有MEF没有和ES很好的分开 ，会将ES一起贴在皿上；,细胞团和颗粒：颗粒大细胞团会导致细胞快速沉 淀并导致细胞贴壁；,如果效果不佳可以进行多次的重复，但是会大大 减少细胞的回收率；,ES细胞的传代：,细胞的克隆出现足够大，细胞的边缘开始出现不 清晰，细胞的克隆出现部分分化的情况；一般的 周期是3-5天；,传代比例依据细胞的克隆大小和细胞的生长状态 ，比例为1：5-1：10；,消化的时候观察一般以MEF为标准，如果MEF 基本上已经开始脱壁就可以终止消化；,挑克隆技术：,当克隆大部分出现分化的时候；克隆大小不均并且生长缓慢；注意事项：,拉针（要注意末端的大小）或使用1ml的注射 器；,在
11、体视镜下操作，要在解剖超净台中操作；注意环境，避免污染；,提取的克隆要消化后才能进行接种；单克隆的培养周期长，要更有耐心；,用于ES囊胚注射的细胞控制：,低代数：（细胞的全能型和基因变异和染色体变 异）,低分化程度：（细胞分化会大大影响细胞最后的 整合的效率和生殖遗传的比例）,最低的控制标准：正常的核型，细胞的各种分化 蛋白没有表达，各种ES的正常表达蛋白正常； 具有成瘤性；增殖速度快；无任何外源污染；,其他类型的成体干细胞,间充质干细胞神经干细胞,间质干细胞是目前研究最多的干细胞,来源研究方向：不断有文章报道从不同的组织分 离出MSC，整体方向是有利临床广泛取材和减 少病人痛苦；,与组织工程
12、结合的研究方式，最重要是如何提 高与组织的相容性和提高在向多个方向分化的控 制，如何成为一个真正的组织；,临床治疗研究，也是目前细胞治疗的研究热点， 国内主要的治疗细胞；,基因研究的载体，干细胞分化机制模型；,Cyagen能够提供协助：,来源研究：基本上从体内的各个组织中发现非常 多的干细胞，包括肌肉，肺部，肌腱，血管，皮 肤等，而这些细胞都具有含量非常少，同时也具 有非常明显的组织特意性，表达非常多的组织特 异性的蛋白；（提供高难度提取服务）,组织材料学：结合纳米材料和其他生物学材料， 用于研究具有临床前景的材料；（细胞相容性， 蛋白表达，细胞分化分析等）,临床研究：如何从单一来源获得大量稳
13、定而且维 持良好的生物学特性的细胞，同时保证生物的安 全性；（提高全套的技术支持和服务）,间质干细胞,定义：来源于中胚层的早期细胞， 能够分化为 多种中胚层和神经外胚层来源的细胞。,来源组织：骨髓、骨膜、脂肪组织、脐血等。来源物种：人、大鼠、小鼠、猴子、犬、兔子、 猪等。,分离方法,骨髓,人，猴子，犬,密度梯度离心法：不同颗粒之间存在沉降系数差 时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度 沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。,大鼠，小鼠，兔子：全骨髓贴壁法,脂肪等组织：,人、大鼠、小鼠： 酶消化法,鉴定方法不同物种的表面标记差异：,表面标志人 ,猴子大鼠小鼠,阳性CD29,CD44,CD
14、71,C D90CD29,CD44,CD105CD29,CD44 ， CD166,阴性CD34,CD45,CD105,C D166CD34,CD45弱阳:CD34，CD45,传代能力,有限增殖，随着传代次数增加，分化能力逐渐降 低，按照1：2的比例：,人：12代达到纯化，最多1520代。,大鼠：34代达到纯化，最多2025代。,小鼠：78代达到纯化，最多2530代。,间充质干细胞培养的问题/解决方案, BMSCs：来源长骨的骨髓，体内与造血功能有紧密关系，,但是也存在牙髓和其他短骨里面，缺点是取材时给病人 的痛苦较多；, ADSCs：来源全身的脂肪组织，包括皮下和内脏脂肪垫；,来源属于微创方法
15、取材，主要是来源于抽脂减肥的手术；, 其他来源的间质干细胞：胰腺干细胞、心脏干细胞、肝脏干细胞、肌腱干细胞和牙周膜干细胞等；还有新生儿的脐带、胎盘等其他组织；, 细胞形态：不同的组织来源的间质干细胞的形态多样，,基本无法从细胞的形态上进行有效的区分；, 表面抗原：不同来源的细胞的表面标记会有差异BMSC和ADSCs的区别就是CD106（+/-）和CD49d（-,/+）；, 分化能力：会有较大的波动，随着不同个体、不同组织,来源会有变化；, 培养液选择：不同来源也是不同！,间质干细胞形态特征,P0,40X,P3,40X,骨髓间质干细胞定向分化为脂肪细胞,梭形、纤维样细胞 原代：克隆样生长 传代后：匀质、涡旋状排列,HumanDog,RatMonkey,MouseRabbit,间质干细胞培养系统,标准：,1.增殖速度变化； 2.细胞分化影响； 3.形态学变化；,4.克隆形成率变化； 5.基因表达影响；,6.使用的特殊要求； 7.价格因素；,如何选择间质干细胞培养系统？, 基础培养基的选择:依据细胞的生长和要求参照文,章进行优化，需要添加部分的氨基酸或者糖；, 血清筛选：应该利用10株以上的细胞，进行克隆,形成率、生长曲线、分化能力的比较；, 添加物：营养物质、抗氧化物质、抗生素、细胞,因子添加；,优选 专业 血清,普通 胎牛 血清,普通 牛血,清,
