生物反应工程

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1、生物反应工程,绪 论 (1学时),典型的生物产品生产过程,生物反应过程的特点,有生物催化剂的参与； 具有独特的反应特性； 反应条件温和； 以可再生资源为主要原料； 易受环境微生物污染； 成分复杂、目标产物浓度低；,生物反应工程的定义,以生物反应动力学为基础，研究生物反应器的设计、放大和生物反应过程的优化操作与控制的学科,生物反应工程的研究内容,反应动力学 微观动力学 宏观动力学,反应器 三传一反 设计与放大 优化与控制,生化反应工程的研究方法,结构模型 半经验模型 细胞多组分、个体差异、不均匀分散 经验模型,生物反应工程的应用,各章学时分配,总学时48 绪论：1 第一章酶催化反应动力学：6 第

2、二章细胞反应动力学：6 第三章固定化生物催化剂反应过程动力学：12 第四章生物反应器的操作类型：12 第五章生物反应器的传递特性：4 第六章生物反应器的混合特性：4 第七章生物反应器的设计与放大：3,第一章 酶催化反应动力学 （6学时）,什么是均相酶催化反应？,酶分子和反应物系(底物分子、产物分子等)处于同一相液相中的反应,均相酶催化反应的主要特征,不存在相间的物质传递，不用考虑传质过程的影响,分子水平上的反应，是本征动力学,酶催化动力学的研究历史,1897年，Buchner 1903年，Henri提出酶与底物作用的中间复合物学说。 1913年，Michaelis和Menten提出了酶催化反应

3、动力学基本模型-米氏方程。 1925年，Briggs和Haldane对米氏方程做了修正，提出稳态学说。,第一节 酶催化反应概论,酶和一般催化剂的共性,能够改变化学反应的速度，但是不改变化学反应平衡。 酶本身在反应前后不发生变化。 降低反应的活化能，加速反应的进行。,酶作为生物催化剂的特性,高效性 专一性 易变性失活：强酸、强碱、高温等 反应条件温和：一般在pH58水溶液中进行，反应温度范围为2040C。,酶的活性部位,非必需基团 必需基团 活性部位（活性中心） 接触基团 结合基团（结合中心） 催化基团（催化中心） 辅助基团,酶的专一性机制,钥匙与锁学说 诱导契合学说,酶的高效性机制,广义的酸碱

4、催化 共价催化 邻近效应和定向效应 扭曲变形和构象变化 多元催化和协同效应,第二节 简单的酶催化反应动力学,一、米氏方程的建立,反应速率的定义 速率控制步骤,1、快速平衡假设,限速步骤 快速平衡 酶的总量保持不变,动力学方程,2、“拟稳态”假设,活性中间复合物浓度的时间变化曲线,活性中间复合物的浓度不随时间变化 酶的总量保持不变,二、米氏方程的动力学特征,米氏常数 最大反应速率一级反应 零级反应,三、动力学参数的求解,1、LB作图法,2、EH作图法,3、HW作图法,4、E-C-B作图法,第三节 有抑制的酶催化反应动力学,酶的抑制作用,不可逆抑制 可逆抑制 竞争性抑制 非竞争性抑制 反竞争性抑制

5、,一、竞争性抑制,动力学方程式与参数,动力学特点,动力学参数的求解,动力学参数的求解（续）,二、非竞争性抑制,动力学方程式,动力学特点,动力学参数的求解,动力学参数的求解（续）,三、反竞争性抑制,动力学方程式,动力学特点,动力学参数的求解,动力学参数的比较,四、底物抑制,动力学方程式,底物抑制反应的优化,第四节 复杂的酶催化反应动力学,一、可逆酶催化反应动力学,反应机理,二、双底物酶反应动力学,顺序机制 乒乓机制 随机机制,随机机制,三、变构酶催化反应动力学,动力学方程式,参数的求取,第五节 反应条件对酶催化 反应速率的影响,一、pH的影响,反应机理式,二、温度的影响,Arrhenius方程,

6、三、酶的失活动力学,贮存稳定性 反应稳定性,1、贮存稳定性,一步失活模型,不可逆失活,半衰期,2、反应稳定性,反应机理,第六节 酶的界面催化反应动力学,特点,反应体系为多相体系； 反应发生在液固或者液液界面上；,1.6.1 液固界面反应动力学,1.6.2 液液界面反应动力学,第二章 细胞反应动力学,第一节 细胞反应概论,一、发展历史,19世纪以前 1857年Pasteur 一战期间 1933年 1945年 1954年White,自然发酵 酒精发酵由yeast引起 丙酮丁醇、甘油发酵 摇瓶培养法 青霉素发酵 补料操作,二、微生物细胞的性质,三、细胞反应过程的主要特征,反应主体为细胞：催化剂；微型

7、反应器 复杂的酶催化体系酶催化反应 细胞反应 反应式 机理式 差别 反应过程复杂 经验式,四、模型的简化,真实情况 多相体系（气液固） 细胞多组分 细胞生长不均一,简化模型 均一化模型：细胞和基质均视为液相 均衡生长模型：细胞各组分按相同比率增加 确定论模型：忽略个体差异，取平均值。,第二节 细胞反应计量学,一、细胞浓度的测定,测定细胞数目 测定细胞重量,1、测定细胞数目,比浊法 计数器计数法 活菌平板计数法,比浊法,分光光度计 菌悬液 只适用于颜色浅、悬浮颗粒极少、细胞沉降慢的发酵液。,计数器计数法,显微镜 血球计数器（酵母、霉菌孢子） 细菌计数器（细菌） 活菌数（亚甲基蓝） 不适用于霉菌、

8、放线菌,活菌平板计数法,无菌生理盐水 稀释、涂布 不适用于丝状菌 慢,2、测定细胞重量,细胞干重称量法 细胞堆积容积测量法 细胞组成成分分析法,细胞干重称量法,DCW（dry cell weight） 100度 适用于丝状菌 必须清除发酵液中非细胞固体物质,细胞堆积容积测量法,锥形刻度管 离心,细胞组成成分分析法,蛋白质、DNA、RNA 在细胞中的含量比例不得随时间变化,二、得率系数Y,对基质的细胞得率Yx/s 对基质的产物得率Yp/s,定义式 微分（瞬时）得率系数 宏观（总）得率系数,三、绝对速率和比速率,细胞比生长速率基质比消耗速率产物比合成速率,第三节 细胞反应动力学 的非结构模型,一、

9、细胞生长曲线,迟滞期 指数生长期 减速期 静止期 衰亡期,1、迟滞期,适应阶段 新酶系的合成 细胞数目基本不变，重量略有增加,2、指数生长期,营养物质充分 达到最大比生长速率 倍增时间,3、减速期,基质浓度降低 有害代谢产物积累,4、静止期,生长速率等于死亡速率 达到最大细胞浓度 死亡速率常数,5、衰亡期,停止生长 细胞浓度下降,二、影响比生长速率的因素,1、基质浓度 Monod方程 Logistic方程,Monod方程,基本假设 均衡生长 一种生长限制性基质 细胞得率为常数,Logistic方程,2、基质抑制,基质抑制动力学（Andrew模型） 最适基质浓度,3、产物抑制,乙醇对酵母,4、温

10、度的影响,动物细胞：3139度 植物细胞：2530度 最适生长温度、最适生产温度,5、pH的影响,细菌：6.37.5 放线菌：78 霉菌、酵母：36 乳酸菌、乙酸菌 动物细胞：6.57.5 植物细胞：56 pH的控制,灭菌方法,化学试剂灭菌 射线灭菌 过滤除菌 热灭菌,三、灭菌动力学,对数死亡律（营养细胞） 非对数死亡律（芽孢）,对数死亡律,非对数死亡律,温度的影响,瞬时高温灭菌(UTH),依据：热死亡活化能营养物质受热分解活化能,第四节 底物消耗与 产物生成动力学,一、底物消耗动力学 1、仅用于细胞生长,比消耗速率和比生长速率的关系,2、用于细胞生长和维持代谢,最大细胞得率（理论细胞得率）

11、细胞维持系数,最大细胞得率和实际细胞得率的关系,3、用于细胞生长、维持和产物合成,二、细胞反应中氧的传递,难溶气体 氧的传递的重要性,在常压和25时，空气中的氧在纯水中的饱和溶解度为0.25mol/m3 工业发酵常用的微生物的比呼吸速率约为0.10.4kg(O2)/hrkg(干细胞),摄氧率OUR、呼吸强度,三、产物合成动力学,初级代谢产物 次级代谢产物,Gaden模型,相关模型（基质的分解代谢产物，如乙醇、乳酸） 部分相关模型（柠檬酸、氨基酸） 非相关模型（抗生素、微生物毒素）,1、相关模型,产物的生成与细胞生长相关，保持同步。 最大值出现在同一时刻。,2、部分相关模型,当细胞生长达到一定程

12、度后产物开始合成。,3、非相关模型,产物生成与细胞生长无直接联系。 细胞生长时无产物积累。 细胞停止生长后产物开始大量合成。,4、特殊的产物：二氧化碳,呼吸熵（respiratory quotient）,第五节 细胞反应动力学的结构模型,2.5.1 分室模型,2.5.2 控制模型,细胞在消耗某一特定底物进行反应时，必定会存在某一特定的关键酶，它是细胞消耗某一特定底物进行反应的瓶颈。,第六节 描述细胞群体反应动力学 的分离模型,1、描述细胞生理特性变化的分离模型,温度,2、描述细胞形态变异的分离模型,丝状微生物,3、描述重组细胞反应的分离模型,质粒的不稳定性,第三章 固定化生物催化剂 反应过程动

13、力学,第一节 固定化生物催化剂概论,酶固定化的意义 酶固定化的方法 影响固定化酶反应动力学的因素,均相酶反应系统的缺点,酶随产物排出，无法重复使用； 增加产物纯化难度； 不稳定，易变性失活,一、什么是固定化酶？,通过物理或化学的方法使溶液酶结合在不溶于水的载体上，或被限制在有限空间内，能与反应液分离，保留在反应器内或能够被回收并反复利用，不溶于水但仍具有酶活力的酶,固定化酶的优点,容易从反应体系中分离 可以重复使用 机械强度和稳定性增加 便于连续化、自动化生产,固定化技术的发展,固定化酶 固定化细胞,1916年Nelson和Griffin发现酵母蔗糖酶能被骨炭粉末吸附并在吸附状态下仍具有催化活

14、性，后来科学家开始了固定化酶的研究工作。 首例工业化应用固定化酶是1969年由Chibata及其同事在日本TanakeSciyaku公司实现的，他们将米曲酶（Aspergillus oryzae）的氨基酰化酶固定后用于拆分合成的外消旋DL-氨基酸，得到相应的旋光性的对映体。,二、酶的固定化方法,载体结合法 交联法 包埋法,1、载体结合法,物理吸附法 共价键法 离子键法,1）物理吸附法,活性炭、硅胶、硅藻土、陶瓷。 酶活收率高 结合力弱，易脱落 简便易行,操作流程：将酶溶液溶解于缓冲液中，加入载体，振荡或者搅拌一定时间后，抽滤、洗涤、冷冻干燥，得到固定化酶。,2）共价键法,利用氨基、羟基、胍基、

15、咪唑基等反应活性高的未结合基团。 易失活、酶活收率低 结合牢固,3）离子键法,离子静电引力 离子交换树脂 操作简单 酶活收率高 结合力弱，易脱离,2、交联法,酶与具有两个或两个以上官能团的试剂反应 戊二醛,特点 不需要载体 反应剧烈，酶活收率低 结合牢固,3、包埋法,将酶包埋在凝胶的微小格子或微胶囊等有限空间内 聚丙烯酰胺凝胶、海藻酸钙、琼脂。,特点 包埋法只适合于底物和产物均为小分子物质的酶的固定化 酶活收率高 制备成本高,概念：酶活力收率,酶活力收率是指实际测定的固定化酶的活力(E3)与固定化时所用的全部游离酶的活力(E1+E2+ E3)之比，包括因未固定化而损失的酶活(E1),概念：酶的活力表现率,酶的活力表现率是指实际测定的固定化酶活力(E3)与被固定化的酶在溶液状态时的总活力之比(E2+E3),三、酶固定化后的变化,底物专一性的改变 pH活性曲线和最适pH的变化 稳定性的变化,四、影响固定化酶动力学的因素,酶结构的改变 位阻效应 分配效应 扩散效应,1、酶结构的改变,2、位阻效应,立体障碍 与底物分子的大小、形状及性质有关。,3、分配效应,分配系数K=Csg / Csi,4、扩散效应,外扩散 内扩散,研究方法,建立包括传质速率和酶的催化反应速率在内的反应速率方程 外扩散 内扩散 内外扩散同时存在,第二节 外扩散对反应速率的限制效应,