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1、番茄热休克蛋白21 的双重作用：保护光系统II 的氧化压力，促进果实成熟过程中的颜色变化Inbal Neta-Sharir,a Tal Isaacson,b Susan Lurie,c and David Weissa,1 a 罗伯特 H.史密斯植物科学和遗传学农业研究所，农业食品和环境质量科学学院，耶路撒冷希伯来大学以色列雷霍沃特，76100 ，b 遗传学系，耶路撒冷希伯来大学，耶路撒冷91904 ，以色列c 采后科学部门，农业研究组织，国家中心，投注达甘50250 ，以色列番茄的叶绿体小分子热休克蛋白（ SHSP ） ， HSP21 ，通过热处理引起的叶片，而且还根据在叶绿体中的有色体，以
2、在过渡期间发育的果实正常生长条件。我们使用的转基因番茄植物组成型表达HSP21研究根据应力条件，并在果实成熟蛋白质的作用。虽然我们并没有找到关于光系统II （ PSII ）耐热性的转基因有什么影响，我们的研究结果表明，该蛋白可保护PSII 从温度相关的氧化应激。此外，我们发现在果实变红蛋白质的作用的直接证据和叶绿体转化为有色体。当植株在正常生长条件下生长，转基因番茄果实类胡萝卜素积累早于对照。此外，当分离的成熟的绿色果实保存2 周， 在 28 ，然后转移至室温，类胡萝卜素的天然积累被封堵。在先前的研究中，我们发现，预热处理，诱导 HSP21 ，让水果的颜色变化在室温下，经过冷处理。在这里，我们
3、表明，成熟的绿色果实的转基因组成型表达HSP21不需要热处理， 以保持冷藏后积累类胡萝卜素的能力。这项研究表明，一个SHSP 在植物发育的作用下正常生长条件下，除了在胁迫条件下的保护作用。引言所有的生物在高温下通过诱导响应合成一组进化上高度保守的多肽被称为热休克蛋白（HSPs ） 。小热休克蛋白（ sHSPs ）范围大小从; 15至 42 kD 和的特征是保守的序列在其C端，与其他的sHSPs生物体和对 - 晶状体脊椎动物的眼睛晶状体的（ Inoglia和 Craig ， 1982; Sun 等， 2002 ）。植物sHSPs构成最丰富多样的组蛋白的合成针对热应激。这些蛋白还可以通过诱导其他环
4、境压力，包括耐寒，耐旱，或盐度，以及在各个发育过程，如胚胎成因，发芽和果实发育（ Wehmeyer 等， 1996 ; Almoguera 等人， 1998; Sun 等人， 2001）。 sHSPs 已经分为基于序列六种不同的类型对齐目，免疫交叉反应性和细胞厢mentalization 。 三个类（CI， CII ，CIII和）已经 beenocalized到细胞质或细胞核，其余的内质网，线粒体和叶绿体。 SHSP合成和之间的关系的应激反应导致了这些蛋白质保护的假设从高温的相关破坏性影响细胞（ Sun 等，2002） 。 虽然这 sHSPs的机制参与细胞的保护不充分的理解，它一直表明， 植物
5、和哺乳动物sHSPs既具有非ATP-体外依赖的，分子伴侣样活性（Lee 等， 1997; 李和 VIERLING ， 2000 ） 。它已被提出， sHSP 结合部分折叠或变性的蛋白，并防止它们的总体性gation和便利其他伴侣折叠（ Sun 等人， 2002 年）。核编码叶绿体sHSPs有一个明显的分子量在21? 30KD 的范围内。这些蛋白质有在所有sHSPs发现了两个保守区域和独特的角闪石化发性，在其N末端，这是高度蛋氨酸丰富的域保存所有已识别的叶绿体sHSPs之间，但没有发现在其他sHSPs （陈和 VIERLING ， 1991 ） 。在使用体外研究分离的叶绿体建议，叶绿体SHSP保
6、护不耐热的光系统II （ PSII ），是重要的热驯化 （ Heckathorn等， 1998 ） 。 然而，类似由他人进行实验并没有证实这些安装前后 - vations （哈 rndahl和松德比， 2001 ） 。此外，虽然叶绿体sHSPs和 PSII 的水平之间的相关性耐热性已被证明在体内（ Heckathorn等， 2002 ; 王和 Luthe ， 2003 年） ，他们的作用的直接证据尚未提供保护PSII 在植物的。转基因拟南芥植物组成型表达的氯塑料SHSP ， HSP21 ，稍微比野生更耐输入的热量和高光应力的组合（哈 rndahl等人， 1999）。这些结果表明， HSP21起
7、着体内的作用在防止随温度变化的氧化应激。但是，目前还不知道保护的机制。这是推测HSP21可以在作为一种抗氧化剂OXI - 与格胁迫条件（ Levine等人， 1996）。番茄（番茄） 叶绿体 SHSPHSP21 ， 也命名 TOM111 （劳伦斯等人， 1997 ） 和 LeHSP23.8 （ Sun等， 2002） ， 是由热处理引起的在叶，花和果实。 它还在正常生长所致温度在水果的转折阶段（即，当果实转红 ;Sabehat等人， 1998; Sun 等人， 2002 ） 。在先前的研究中，我们发现饲养绿熟番茄果实很长一段时间（ 2 至 3 周）在低温（ 28 ）会导致冷伤害和抑制后的正常成
8、熟和类胡萝卜素积累其传输至室温。然而，露出水果高温（ 388C ） 2 天的冷库前保护它们，并且允许熟化在室温下， 在 cluding变红（ Sabehat等人，1996）。 我们还发现， 该热处理诱导HSP21 mRNA的积累果实。 长期储存后的谈话内容也被发现加热果实在低温下。因此， 我们推测HSP21可以在果实成熟中发挥作用。尽管对 Hsp21 的分子基础在深入研究其在体内的分子伴侣活性及其保护的目标仍然是知之甚少。此外，该蛋白在果实中的作用发展尚未研究。在这项工作中，使用转基因番茄植物组成型表达 HSP21 ，我们表明，在蛋白质可保护PSII 从温度依赖性氧化压力。此外，我们提出的蛋白
9、质的作用的证据在果实发育，特别是在种类胡萝卜素的积累noids在成熟。结果Hsp21保护 PSII 免受氧化应激几项研究已经表明， Hsp21 保护不耐热的在孤立的叶绿体热应激期间PSII （ Heckathorn等， 1998）。然而，其对 PSII 在植物中的保护作用是不证明。分析HSP21的体内功能，我们转化VF36 番茄植物与含有构建体的驱动HSP21 （登录号 U66300 ）的开放阅读框由花椰菜花叶病毒的35S 启动子。独立转基因植物下表现出高 HSP21表达水平正常生长条件下（三个独立的转化：T0- 311 ， T0- 831 ，和 T0 -1041 ）自花授粉。 T1 的后代首
10、先通过PCR分析来选择转基因植物和然后根据HSP21转录和蛋白水平分析正常生长条件下（图 1） 。高水平的 HSP21的转录和蛋白中发现了转基因株系，但无法控制， 非转基因VF36植物。DNA凝胶印迹分析证实了转基因到植物基因组中的整合并透露的两个副本中的T1 -311 的存在和单拷贝在T1- 831 和 T1- 1041 （数据未显示）。然而，这些差异并不影响HSP21的在不同行中的表达水平。选定T1 代（从在三个依赖的转基因株系）进行自花授粉，以产生T2 后代。 T2，T3，和在本研究中使用T4 植株是纯合或杂合的，但所有被第一对HSP21表达分析，以确保在正常生长的温度（ 258 ）高的
11、水平转录物。图 1。分子分析（ PCR ，RNA凝胶印迹和蛋白质凝胶印迹）转化与 35S-HSP21建构转基因番茄植物。 DNA，RNA和蛋白质的对照非转基因植物和三个T1 代植株从三个始发独立反式提取形成。从转基因离体叶片（三个独立的T2 转 基因株系）和对照植株在培养瓶用自来水水和暴露 2.5 小时至40 或 508C。 PSII的量子产率通过 MEA- 应力处理后立即进行分析 suring叶绿素荧光（图2A）。在 PSII无变化活动被发现在所有被检查的树叶。揭离体叶片为508C一段较长的时间（3.5 小时），导致控制和转基因叶片中PSII 不可逆转的损害（数据未显示）。进一步的尝试来评估
12、是否转基因促进PSII 耐热性，逐渐 increas - ing 的温度和 / 或减少曝光时，没发现任何效果：既转基因和对照植株要么没有影响或类似损坏（数据未显示）。以往的研究表明， HSP21保护氯化物从温度相关的氧化应激，但不能roplasts从热应激（哈 rndahl等， 1999 ） 。因此，我们面临叶到高温，然后以高的光，一个组合已知会导致氧化应激（浅田，1996）。离体叶片（从三个独立的T2 株系）中孵育小瓶用自来水和暴露于40 ，47，或 508C为 2 小时，然后暴露2分钟，高光（ 1200 毫摩尔米 2 秒 1） 。分析对 PSII 活性的复合应力， 叶绿素的影响荧光量子产率
13、的测定。这一直前叶所构成408C ，然后到光并没有显示在PSII 的任何减少活性 （图 2B）。 在孵化和 508C 曝光后，在所有的转基因株系与对照叶片的PSII 活性严重减小（图2D） 。转基因叶片中孵育在该478C ，然后暴露在光表现出一些， 尽管不是显著， 公差 （即 PSII 在这些叶片活性略有比对照叶片中的含量高）（图 2C）。图 2。热和高光胁迫对在控制和转基因番茄植株表达HSP21的高层次 PSII 活动。 （A）离体叶片的转基因株系（ T2-311 ，黑条）和控制（白条）暴露于40 或 508C2.5 小时，然后叶绿素荧光产量（可变荧光/ 最大荧光 FV/ FM）为测量。（B
14、）至（ D）离体叶片（从三个独立的T2 代转基因系和对照）暴露于408C （B）478C （C），或 508C（D）为 2 小时，然后向高白光（ 1200 毫摩尔米 2S1）2 分钟。叶绿素荧光产量，然后测量。黑色条代表叶绿素荧光yieldbefore护理和灰条代表叶绿素荧光。胁迫处理后产生。每个值代表平均为 10。测量来自 10 个不同的叶子6 SE 服用。番茄叶积累HSP21响应热应激（ Sabehat 等人， 1998）。这可能是在实验中如上所述，控制植株迅速合成 HSP21在响应于该高温处理，因此，该转基因和对照植株之间差异不显著。由于氧化应激也可通过诱导结合寒冷和高光应力 （ All
15、en和的 Ort ， 2001 ） ， 两者都不诱导HSP21的积累（ Sabehat等人， 1998 ） ，我们检测了转基因的对PSII 的效果在首次暴露在低温和树叶活动然后以高光。离体叶片由三名独立转基因品系（ T2）和控制 VF36 孵育在小瓶中与在48自来水中 3 天，然后暴露2 分钟到高光（ 1200 毫摩尔米2S 1 ） 。图 3A 显示了一个严重减少在控制PSII 活性的组合应力后离开。上另一方面，所有被测试的转基因品系表现出正常的PSII 活动。当叶片在48 ，但不温育3 天暴露于高光， PSII无损伤，观察两种控制或转基因品系 （图 3B） 。此外， PSII活性并没有受到影
16、响时，叶片暴露在高光无预温育，在低温（数据未显示）。为了测试在PSII 活性的降低是否依赖于光的强度，冷处理的叶片（ 3 天在 48 ）的控制和一间独立代表性的转基因株系暴露于低或高光强度（600 和 1200 毫摩尔米 2 秒 1 ，分别）。虽然在控制叶片 PSII 活性无明显影响接触低光强，强还原性与高光（图3C ）光照后发现。 PSII活性在转基因烟草，上另一方面，没有受到高或低的光。这些结果表明， HSP21的叶绿体中积累转基因植物的光依赖的氧化应激保护 PSII 。这些实验重复与T3 的植物和类似结果发现。HSP21促进类胡萝卜素的积累过程中果实成熟成熟过程中HSP21诱导的番茄果实;其成绩单在转动阶段，当类胡萝卜素色素是首次发现开始积累（图4） 。为了研究可能发挥的作用HSP21在果实成熟过程中，我们比较了果实发育控制VF36品种与转基因植物。反式基因果实积累高水平的HSP21成绩单在其整个发展（图 4） 。我们花标记从控制和转基因（三个独立的T2 代转基因线）植物在开花期和随后果实发育和成熟。图5A 显
