《超声破碎细胞问题汇总》由会员分享，可在线阅读，更多相关《超声破碎细胞问题汇总（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、超声破碎细胞问题汇总 2008年 12 月 11 日 星期四 15:31 大肠杆菌表达外源蛋白，在超声破碎的时候，用含有1%triton-X-100的 PBS悬 浮，然后超声的效果较好，1%triton-X-100的作用还是很明显的，对其他的一 些细菌同样起作用，比如链霉菌。细菌沉淀直接加样品1buffer ，再加 5ul 的巯基乙醇， 混匀，离心，煮沸 10min， 直接上样，染色脱色步骤如下: 将胶放入适量的染色液微波炉里加热1min( 下次 适当补点醋酸即可 ), 将染色液换成大量的水 ( 自来水即可 ) 在微波炉煮 10min 就 可以. 在表达重组蛋白后超声波破碎细胞，采用冰浴，40
2、0w ，破 2s 停 1s，但是不一会 就产生大量泡沫，影响了破碎功率，pbs 和 tris缓冲液都是这样，最后都是破 碎不完全，而我的目的蛋白就在这些未破碎的细胞中。？ 1*会产生气泡是因为你的探头位置没放好。探头一定要接近底部，约1cm （我一 般是距底部 0.5mm ）。功率根据仪器不同会有所不同，但你可以观察液面，有波 动但不要太剧烈就好。 2*破 3S停 10S ，破个二三十次看看。 3*变幅杆位置摆放也要注意， 听声音如果不对的话就要及时调整。另外可以从菌 浓度方面考虑。在破碎时试着加大体积 , 强度最好不要超过60%. 4*尝试超 8s 停 8s, 对有些菌体蛋白来说，你的方法很
3、难散热，导致蛋白变性产 生气泡，最好停顿时间稍长一些，这种情况多见于包涵体形式的蛋白。链霉菌（放线菌）超声破碎的，用的方法条件是什么？ 前处理一般就是配置成一定浓度的菌悬液。使用超声破碎时采用的具体条件是：(1) 取细菌的 24 h培养液于 5 000 r min 下离心 5 min 收集菌体 (2) 用 pH 75 的 Na2HPO -NaH2PO 缓冲液洗涤 3 次， 再用该缓冲液将菌体配成1： 3 的菌悬液置 于 40 mL 大塑料试管内 (3) 将大塑料试管置于冰浴中，采用超声波破碎(功率 200 W ，12”探头，破碎 30 s，间歇 30 S) (4) 破碎液于 12 000 r
4、min 下高 速冷冻离心 30 min ，收集细胞碎片和上清夜 超声破菌流程与上述基本一致，就是洗涤菌体也可以用预冷的生理盐水或pH8 的 Tris HCl，洗涤一次就可以。另外，超声剂量随样品量、菌体改变比较大， 功率可以到 400600w ，超 5s，停 5s，冰浴，要加终浓度1 mM 的 PMSF 。为确定 合适的超声强度和次数，有必要随时镜检观察菌体是否完全破碎。 放线菌属于原核生物系统进化树上的（G C ）摩尔百分含量（ mol）高的革兰 氏阳性菌（Eubacteria ） 分枝类群，它虽然具有原核生物特有的分子生物学特性， 但在其不同类群中，细胞壁的化学组分变化很大。在做大肠杆菌超
5、声时，采用的是400W ，超 5 停 5 的方法，效果不错，但是用在 链霉菌上， 似乎没什么效果。 会不会就是由于细胞壁组成差异造成的呢，因为大 肠杆菌式属于革兰氏阴性菌的。再有镜检是检验破碎效果, 但是细胞破碎程度和我需要的酶获得之间有正比关系 吗？破碎时间长也会影响到酶的活性。所以想问问 anaisai战友，你提供的“功 率 200 W ，12”探头，破碎 30 s ，间歇 30 S”的条件好像是用于破碎链霉菌 孢子的，也可以用于发酵离心后的菌泥吗？如果可以，你破碎的全程时间大概是 多少呢？ 如果你需要的是胞内酶，细胞破碎程度和需要的酶获得之间基本上有正比关系。 破碎时间长的确会影响到酶的
6、活性。 这就需要在最佳的破碎时间和酶活性之间做 出判断，最直接的办法是先绘制相关曲线（酶活性和时间的关系曲线）。我的实验中，破碎的是棒状杆菌 （也是很难破壁的G+ 菌）， 破碎时间控制在 30min 左右，酶活较好。 如果是基质菌丝的话 , 好可以考虑用溶菌酶处理一下. 一般来讲这几种方法读可以的: 一, 液氮研磨 二, 用 french press破碎 三，超声波破碎 四，溶菌酶处理预处理为什么用塑料大试管 , 玻璃的不可以吗？答：不可以的：）那么先让我来解释一下超声破碎的原理吧。超声波是物质介质中的一种弹性机械波，它既是一种波动形式, 又是一种能量形 式。超声对细胞的作用主要有热效应，空化
7、效应和机械效应。 热效应是当超声在 介质中传播时， 摩擦力阻碍了由超声引起的分子震动，使部分能量转化为局部高 热（4243）。空化效应是在超声照射下，生物体内形成空泡，随着空泡震动 和其猛烈的聚爆而产生出机械剪切压力和动荡。另外，空化泡破裂时产生瞬时高 温（约 5000）、高压（可达500104Pa ），可使水蒸气热解离产生.OH自由 基和.H 原子，由 .OH自由基和 .H 原子引起的氧化还原反应可导致多聚物降解、 酶失活、脂质过氧化和细胞杀伤。 机械效应是超声的原发效应，超声波在传播过 程中介质质点交替地压缩与伸张构成了压力变化，引起细胞结构损伤。 损伤作用 的强弱与超声的频率和强度密切相
8、关。所以如果使用玻璃管，可能会碎裂，而通常使用的是塑料试管。 100g大肠杆菌溶于 1L 破碎液里（破碎掖： 50mM Tris-Cl(PH8.5) 5mM EDTA 0.14M NaCl），搅拌，发现菌液发粘，菌体不能够很好分散，用高压匀质机破碎，加压 后，菌液不能进入匀质机， 速度很慢，请问是何原因？能有好的办法解决，很好 用匀质机快速破碎菌体？ 将破碎液的量加大 不能很好分散可能是量太大超声处理 510 分钟，菌液粘度即可大大降低，也可促进菌体分散。 不同型号的设备功率不一样，功率的大小决定了使用变幅杆的大小范围（直径 2mm 至几十毫米） ，你使用多大的变幅杆就在设备的上调至该刻度（很
9、简单的） ！ 变幅杆的大小决定了处理量5ml 一下选 3mm ，550ml 可选 68mm ，50ml 以上选 10mm 的变幅杆，依此类推！占空比不用关心的，主要是指超声时间和停顿时间 的比值。酵母破碎的问题 / 一般的 PROTOCOL都是用 glass beads 破碎酵母细胞 sigma G-8772 酵母破碎效果好的我所做过的方法中还是玻璃珠， 效率很高，而且对目的蛋白活性不会有什么影响。一般应该用这个方法。化学裂解的方法， 10g酵母 加 1ml 的乙酸乙酯，充分搅拌至液体状。此法的裂 解效果不错的 加尿素裂解液（尿素8mol/L, NaCl 0.5mol/L,Tris 20mmo
10、l/L, EDTA 20mmol/L, 2%SDS, PH 值 8.0 ），据说效果可以 毕氏酵母细胞破碎法 文献上的方法： The pelleted cells were resuspended in 200 ll 18 M NaOH, 12 M b -mercaptoethanol, and incubated for 5 min on ice. After addition of 200 ll 10%TCA, the mixture was incubated for 5 min, centrifuged, and the pellet was resuspended in 50 ll
11、2?SDS-PAGE loading buffer and neutralized at pH 70 by adding 510 ll 1 M Tris base. The samples were heated to 95 C for 3 min before loading onto SDS-PAGE gels (12% acrylamide). 若是想得到胞内蛋白可以用蜗牛酶处理，效 果比较好！ 在破碎遇到的问题是菌体浓度太低，OD620nm 在 4-6 之间。细胞破碎仪的最低破 碎体积为 4ml 左右，这样我再稀释一倍，OD就到 2-3 啦，我怀疑破碎完溶出蛋 白和酶活测定时会测不准。
12、 所以请教大家细胞破碎时最低的菌浓多少为下限？我 的菌是一种棒杆菌。 破碎后，你可将液体放入透析袋中浓缩呀 我所做的方法是按照1：20 的比例将离心后的菌体 （e.coli）溶解于超声缓冲液 （50mM 磷酸 pH 8.0 ）300w 10s/10s 破碎 20分钟。做了镜检！基本全被破碎 了！我做蛋白纯化的， 做的包涵体。 实验中我的菌体浓度相对独立，与培养液中 的菌体 od 无关，不收其限制，便于操作者调控。供参考 一般按每 g 湿菌体加 5-10ml 裂菌缓冲液。我们一直这样做，很好。 超声肯定会产热，所以一定要有降温装置，除非你需要得成分耐高温：）MilliQ 纯水系统清洗将纯水机调至待机状态（standby） ，出水管接到空桶（放废液）称取 3gNaOH ，放入纯水机背面的圆筒里，拧紧盖子长时间按住 clean 键直至屏幕显示 cycle 取下面出水口下面的滤膜装置，按照屏幕提示打开出水开关，21min （其间出水口会流出较多水）按屏幕提示关上，清洗421min（过夜）第二天开启纯水机并安装好滤膜装置，放回出水管，清洗完毕待用
