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1、ELISA检测乙肝抗体,第三小组,肝表面抗体ELISA检测,实验目的,1.掌握ELISA的原理和操作方法。,2.熟悉酶标仪的使用方法。,免疫标记技术是用荧光素、酶、或者放射性核素等标记抗体或抗原，利用标记技术的高度敏感性进行的抗原抗体的反应。,免疫标记技术,细胞1,细胞2,标记物,分 类,荧光素,放色性核素,酶,放射免疫技术,免疫荧光技术,酶免疫技术,酶免疫技术,用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。 可用酶标测定仪测定光密度（OD）来反应抗原或抗体含量，灵敏度可达到ng-pg/ml水平。,酶具有高效催化性：可以加快化学反应的速度 ；在反应前后，没有质和量的改变；微量的酶便可发挥巨大的催化作
2、用。,无色,有色,酶免疫技术,酶联免疫吸附试验,酶免疫组化法,用于检测可溶性抗原或抗体,用于检测组织中或细胞表面的抗原,酶联免疫吸附试验-ELISA,ELISA是一种免疫测定（immunoassay，IA）。 抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记； 加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物； 产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。,酶联免疫吸附试验-ELISA,实验原理,抗原或抗体吸附到固相载体表面后，以及抗原抗体与酶连接后，仍保持免疫活性和酶活性，当酶遇到相应底物时，在酶的催化下引起底物水解显色。产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定
3、性或定量分析。,此法的特异性及灵敏度与荧光及同位素标记相似，但其方法较以上两者简便，且不需特殊贵重仪器。因此，这项技术目前正越来越广泛地被应用到医学的各个领域中。,ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体，即“免疫吸附剂“（immunosorbent）； （2）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物“（conjugate）； （3）酶反应的底物。,ELISA的类型,间接法（测抗体）双抗体夹心法（测大分子抗原）竞争法（测小分子抗原）,间接法,将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原；,加酶标抗体：与固相抗原抗体复合物中的抗体结合，使该抗体问接
4、地标记上酶；,加受检血清：其特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。,固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。,传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。,双抗体夹心法,特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体； 标本中的抗原与固相载体上的抗体结合成固相抗原复合物； 加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合， 酶量与标本中受检物质的量成正相关；,酶标抗体,血清样品 或参比品,底物,加底物：夹心式复合物中的酶催化 底物成为有色产物,酶标仪测定OD值,终止液,根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例
5、如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。,竞争法,用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，将特异性抗体吸附于固相载体表面，经洗涤后分成两组：一组加酶标记抗原和待测抗原的混合液，而另一组只加酶标记抗原，再经孵育洗涤后加底物显色，这两组底物降解量之差，即为所要测定的未知抗原的量。,这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位就可，因此，对小分子抗原如激素和药物之类的测定常用此法。该法的优点是快，因为只有一个保温洗涤过程，但需用较多量的酶标记抗原。,操作步骤,1.从冰箱取出试剂盒，室温平衡30分钟。2.按如下
6、方式加待测血清，每孔1滴。,待2,待3,待1,阳性,阴性,空白,3.每孔加酶结合物1滴（孔上方悬空滴加，无气泡），混匀，空白孔不加，置37度温箱30分钟。,4.取出反应板，弃液，拍干。 5.每孔注满洗涤液，（不要溢出）静置5秒后弃液，拍干，重复洗涤5次，拍干。 6.每孔加显色剂A和B各1滴，置37度温箱15分钟。 7.每孔加终止液1滴混匀，观察结果。,结果观察,结果观察,乙型肝炎病毒采用ELISA检测法具有操作简便、灵敏度高、试剂成本低、环保和适用于大批量人群抗原、抗体筛查等优点,目前在国内实验室被广泛使用。 缺点易产生假阳性结果。,酶标仪洗板机,排枪加样,酶标仪,乙肝病毒（hepatitis
7、 B virus, HBV）抗原,抗体: 1、表面Ag（HBsAg） HBsAb 2、核心抗原（HBcAg） HBcAb 3、e抗原（HBeAg） HBeAb两对半： HBsAg HBsAbHBcAbHBeAg HBeAb,HBV-Ag、Ab检测结果临床分析HBsAg HBeAg HBsAb HBcAb HBeAb+ - - - - HBV感染/无症状携带者+ + - - - 急性/慢性乙肝/无症状携带者+ + - - + 急性/慢性乙肝（传染性强，大三阳）+ - - + + 急性感染趋向恢复（小三阳）- - + + + 既往感染恢复期- - + + - 既往感染恢复期- - - - + 既往感染或“窗口期”- - + - - 既往感染或接种过疫苗,Thank you！,
