分子生物学,大连大学生物工程学院 迟彦,第六章 蛋白质生物合成 (Protein biosynthesis),,3,4.4.5 蛋白质前体的加工,N-端fMet或Met的切除 二硫键的形成：两个半胱氨酸氧化生成胱氨酸 特定氨基酸的修饰 切除新生肽链中的非功能片段,4,N-端fMet或Met的切除,原核生物的肽链，其N-端不保留甲酰基，大约半数蛋白由脱甲酰酶（deformylase）除去甲酰基，留下Met作为第一个氨基酸；在原核及真核细胞中fMet或者Met一般都要被除去，此是由氨肽酶（amino peptidase）水解来完成的5,二硫键的形成,mRNA中没有胱氨酸密码子，而不少蛋白质都含有二硫键，这是蛋白质合成后通过两个半胱氨酸的氧化作用生成的 二硫键的正确形成对稳定蛋白的天然构象具有重要作用,6,特定氨基酸的修饰,磷酸化，糖基化，甲基化，乙酰化，羟基化，羧基化氨基酸侧链的修饰作用包括磷酸化（如核糖体蛋白质）、糖基化（如各种糖蛋白）、甲基化（如组蛋白、肌肉蛋白质）、乙酰化（如组蛋白）、羟基化（如胶原蛋白）和羧基化等，图4-23是生物体内最普通发生修饰作用的氨基酸残基及其修饰产物7,,,8,,磷酸化由蛋白激酶催化丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸,9,,甲基化 由N-甲基转移酶催化 细胞质内 Arg 、His、Gln,10,,糖基化内质网中糖基化酶催化 分泌蛋白和膜蛋白几乎都是糖基化蛋白,11,,,12,切除新生肽链中的非功能片段,新合成的前胰岛素（preproinsulin），在ER中切除信号肽变成了胰岛素原（proinsulin），它是单链的多肽，由3个二硫键将主链连在一起，弯曲成复杂的环形结构。
分子由A链（21aa）B链（31aa）和C链（33aa）三个连续的片段构成当转运到胰岛细胞的囊胞中，B链被切除，成为由A，C两条分开的链由3个二硫键连结成成熟的胰岛素13,,图4-25 蜂毒蛋白只有经蛋白酶水解切除N-端的22个氨基酸以后才有生物活性该胞外蛋白酶只能特异性切割X-Y2肽，其中X是丙氨酸，天门冬氨酸和谷氨酸，Y是丙氨酸或脯氨酸14,4.4.6 蛋白质的折叠,分子伴侣：能够在细胞内辅助新生肽链正确折叠的蛋白质 两类分子伴侣家族：热休克蛋白 伴侣素 伴侣分子在新生肽链折叠中主要通过防止或消除肽链的错误折叠，增加功能性蛋白质折叠产率来发挥作用，而并非加快折叠反应速度15,4.4.7 蛋白质合成的抑制剂,阻止mRNA与核糖体结合（氯霉素） 阻止AA-tRNA与核糖体结合（四环素） 干扰AA-tRNA与核糖体集合而产生错读（链霉素，新霉素，卡那霉素）,16,,嘌呤霉素是AA-tRNA的结构类似物，不需要延伸因子就可以结合在核糖体的A位上，抑制AA-tRNA的进入它所带的氨基与AA- tRNA上的氨基一样，能与生长中肽链上的羧基生成肽键，这个反应的产物是一条3′羧基端挂了一嘌呤霉素残基小肽，肽酰嘌呤霉素随后从核糖体上解离出来，所以它是通过提前释放肽链来抑制蛋白质的合成的。
17,,氨基酸的羧基与tRNA3-OH 缩水形成酯键,18,,19,4.5 蛋白质运转机制,不同功能的蛋白质离开核糖体后，被输送到细胞质、细胞核、内质网、溶酶体、线粒体、叶绿体等各个部分，行使其功能20,表4-13 几类主要蛋白质的运转机制,21,根据蛋白质的定位可以将其大致分为两类：,非膜结合型蛋白质:非膜结合型蛋白质在核糖体(游离Free)中合成后被释放到胞质中有些蛋白质从核糖体上释放后停留在胞质中；为了转运到其专一的位点，还需要一个适当的信号，可以使其组装为大分子结构或被转运系统识别 膜结合型蛋白质：合成这些蛋白质的核糖体结合在内质网上，使新生肽链能在翻译的过程中进入膜内，然后被高尔基体中的转运系统转运到它们特定的位点22,,翻译后转运的蛋白质在核糖体上合成后被释放到胞质中去，具有信号序列的被定位到各个细胞器(如细胞核、线粒体等)中 翻译和转运同时进行的蛋白(共转运蛋白)在合成过程中与内质网相连，所以它们地核糖体是“膜结合”的膜结合型蛋白穿过内质网，经过高尔基体，接着跨过细胞膜如果这些蛋白有驻留信号，则会在此旁路的各个环节中停留，或被定位于各种细胞器(如溶酶体、内吞体等)23,4.5.1 翻译运转同步机制,信号肽假说——蛋白质定位的信息存在于该蛋白质自身结构中，通过与膜上特殊受体的相互作用得以表达。
信号肽——在起始密码子后，有一段编码疏水性氨基酸序列的RNA区域，这段氨基酸序列就称为信号肽长度一般在13-36个残基之间，有三个特点：,24,信号肽特点,（1）一般带有10-15个疏水氨基酸；丙氨酸、亮氨酸、Val、异亮氨酸、笨丙氨酸 （2）在靠近该序列N-端常常有1个或数个带正电荷的氨基酸； （3）在其C-末端靠近蛋白酶切割位点处常常带有数个极性氨基酸，离切割位点最近的那个氨基酸往往带有很短的侧链（丙氨酸或甘氨酸）25,,,26,,①核糖体组装、翻译起始； ②N端信号肽序列的翻译（50-70aa）； ③SRP与核糖体、GTP以及带有信号肽的新生蛋白质结合，肽链延伸暂时终止； ④核糖体-SRP复合物与膜上的受体相结合； ⑤多肽合成才恢复进行，GPT水解，释放SRP； ⑥肽链重新开始延伸并不断向内腔运输； ⑦信号肽被切除； ⑧多肽合成结束，核糖体释放27,,SRP同时识别正在合成需要通过内质网膜进行转运的新生肽和自由核糖体，同时导致了该多肽合成的暂时终止 SRP-信号肽-多核糖体复合物即被引向内质网膜并与SRP受体结合只有SRP与受体结合，多肽合成才恢复进行28,,SRP与受体结合很可能导致受体聚集而形成膜孔道，使信号肽及其相连的新生肽的得以通过。
翻译结束，核糖体大小亚基解离、受体解聚，通道消失，内质网膜也恢复完整的脂双层结构29,4.5.2 翻译后运转机制,线粒体蛋白质跨膜运输 叶绿体蛋白质跨膜运输 核定位蛋白的转运机制,30,4.5.3 核定位蛋白的转运机制,在细胞质中合成的蛋白质一般通过核孔进入细胞核，核孔是进行双向转运的分子通道 所有核糖体蛋白都首先在细胞质中被合成，运转到细胞核内，在核仁中被装配成40S和60S核糖体亚基，然后运转回到细胞质中行使作为蛋白质合成机器的功能 RNA、DNA聚合酶、组蛋白、拓扑异构酶及大量转录、复制调控因子都必须从细胞质进入细胞核才能正常发挥功能31,,在绝大部分多细胞真核生物中，每当细胞发生分裂时，核膜被破坏，等到细胞分裂完成后，核膜被重新建成，分散在细胞内的核蛋白必须被重新运入核内，因此，为了核蛋白的重新复位，这些蛋白质中的信号肽-被称为核定位序列一般都不被切除32,,分子质量较小的蛋白质：自由通过NPC(核孔复合体）或采取被动扩散的方式进入细胞核 分子质量较大的蛋白质：需要通过主动运转进入细胞核这种蛋白质需要带有核定位信号（NLS)序列和出核信号（NES)序列，才能被相应的核转运蛋白识别。
33,NLS (nuclear localization sequence)：核定位序列,核定位序列一般都不被切除 NLS可以位于核蛋白的任何部位34,,载体蛋白（carrier)或称转运受体（transport receptor) 携带底物通过核孔，并且载体蛋白必须跨膜返回，这样可以在下一次循环中行使功能 转运分两步：锚定，既与核孔结合；转运，即穿过核孔的转运35,,蛋白质向核内运输过程需要核运转因子（Importin）α、β和一个低分子量GTP酶（Ran）参与 α和β组成的异源二聚体是核定位蛋白的可溶性受体，与核定位序列相结合的是α亚基这些蛋白组成的复合物停靠在核孔处，依靠Ran GTP酶水解GTP提供的能量进入细胞核，α和β亚基解离，核蛋白与α亚基解离，α和β分别通过核孔复合体回到细胞质中，起始新一轮蛋白质转运,36,4.6 蛋白质的修饰、降解与稳定性研究,4.6.1 泛素化修饰介导的蛋白质降解 在大肠杆菌中，许多蛋白质的降解是通过一个依赖于ATP的蛋白酶（称为Lon）来实现的当细胞中存在有错误或半衰期很短的蛋白质时，该蛋白酶就被激活每切除一个肽键要消耗两分子ATP； 在真核生物中，蛋白质的降解需要泛素(Ubiq-uitin)，只有76个氨基酸残基，序列极为保守。
与泛素相连的蛋白将被送到一个依赖于ATP的蛋白质降解系统(Proteasome)中直到完全降解37,,泛蛋白与将被降解的蛋白的连接需要E1，E2，E3三个降解因子参与泛素激活酶(Ubiquitin-activatingenzyme)E1泛素结合酶(Ubiquitin conjugating enzyme)E2泛素连接酶(Ubiquitin ligas)E3,38,,泛素激活酶E1，利用ATP将其自身通过一个高能硫酯键在Cys残基与泛素C端的Gly相连39,,接着泛素被传递到泛素结合酶E2，后者随后将泛素传递到底物上与底物蛋白质的Lys上ε-NH2形成异肽键( Isopeptidebound)40,,41,,将一个泛素残基加在蛋白质上不足以使其降解更多的泛素残基加入产生多聚泛素链，在这个链中，每一个泛素分子都加在前一个泛素分子的46位Lys残基上42,,,43,,多泛素链被蛋白酶体“帽”识别，将带有泛素链的蛋白质送入蛋白酶体圆筒腔中降解蛋白质被切割成许多小的肽片段，而泛素分子保持完整44,4.6.2 蛋白质的SUMOylation,SUMO: small ubiquitin-related modifier, 小泛素相关修饰物 SUMO化修饰可阻碍泛素对底物蛋白的共价修饰，提高了底物蛋白的稳定性；能修饰许多在基因表达调控中发挥重要作用的蛋白质，包括转录因子、转录辅助因子等；影响蛋白质亚细胞定位，广泛参与细胞内蛋白质与蛋白质相互作用，DNA结合、信号转导、核质转运等重要过程,45,4.6.3 蛋白质的NEDDylation,类泛素化修饰（NEDDylation）不会引起蛋白质的降解，主要通过该种修饰来调节蛋白质的功能 NEDDylation可能参与细胞增殖分化，细胞发育，细胞周期，信号转导等重要生命过程的调控 NEDDylation异常会导致人类的神经退行性疾病和癌症,46,,,,4.6.4蛋白质的一级结构对蛋白质稳定性的影响,N一末端规则,如末端为Asp、Arg、Leu、Lys、Phe等则在数分钟内可以被识别和降解；而末端为Ala、Gly、Met、Ser、Val、Thr则需要lO小时以上。
47,要点,蛋白质前体加工 蛋白质合成的抑制剂-嘌呤霉素 信号肽假说 SRP作用 核定位序列特点 蛋白质修饰的种类及其作用,Thank You !,,。