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1、抗肿瘤药物筛选,张冬梅,一、导论 二、整体动物水平的筛选 三、细胞水平的筛选 四、酶水平的筛选 五、展望,一、导论,1. 肿瘤发病率和死亡率,全球每年癌症新发病例都在1200万以上,因癌症死亡人数达760多万,到2010年底全球肿瘤病人总数已逾5500万人 (WHO)。,心脏病,脑血管病,肿瘤 25%,消化系统病,肺病,其他,中国每年新增肿瘤病人200万人,死亡130-170多万人左右,目前全国肿瘤患者总数约450万人,并以每年3%的速度递增。肿瘤已经成为中国公民的头号杀手,每年因恶性肿瘤而死亡的人口占到总死亡率的22%。,2009年中国居民主要疾病死亡率及死亡原因构成,(中国卫生年鉴),9年
2、中国常见恶性肿瘤的死亡率,我国居民常见癌症死亡率:胃癌列肿瘤死亡率首位;其次肝癌、肺癌、食管癌、结直肠癌等。,2. 肿瘤的治疗方法,外科手术治疗放射线治疗化学药物治疗,3. 常用的化疗药物,烷化剂 环磷酰胺、异环磷酰胺 抗代谢药物 甲氨蝶呤、氟脲嘧啶、阿糖胞苷 抗肿瘤抗生素柔红霉素、阿霉素、丝裂霉素、多柔比星 铂类化合物顺铂、卡铂、奥沙利铂 抗肿瘤植物药长春新碱、依托泊苷、替尼泊苷、紫杉醇 激素类 血管新生抑制剂 贝伐珠单抗注射液、舒尼替尼、索拉非尼,化疗药物的主要不良反应,骨髓抑制(血细胞减少) 胃肠道反应(恶心、呕吐、食欲不振等) 全身反应(脱发、发热、皮疹) 对各器官影响 (心脏毒性、肝
3、脏毒性、神经毒性) 泌尿道毒性(血尿、蛋白尿、尿酸性肾病) 局部静脉炎 致畸、致突变、致癌,4. 天然产物与抗肿瘤药物,天然产物在新药及新药先导化合物的发现中起着不可替代的作用,是结构新颖和作用独特的抗肿瘤化合物的重要来源。美国国立癌症研究所(NCI)从1955年开始从天然产物中筛选抗肿瘤药物。目前世界上被批准广泛使用的抗肿瘤药物中,以上来源于天然产物。,二、整体动物水平的筛选,非实体瘤动物模型,常用小鼠腹水瘤动物模型表(细胞株及动物) 国内外推荐模型,肿瘤移植方法:,1)无菌操作2)接种部位:腹腔3)癌细胞悬液的制备及接种接种710天小鼠处死,酒精消毒,穿过腹 部肌肉吸取腹水24 mL*,置
4、冰块上保存。细胞计数后,PBS稀释制备1x107/0.1 mL细胞浓度悬液,每只小鼠注射0.2 mL 肿瘤细胞悬液注射到腹腔。5天左右,小鼠出现腹水即为造模成功。*腹水应为白色浓稠液体,若为黄色或红色应弃去,给药及药效评价:,动物分组:随机分五组(溶剂对照组、阳性药组、高、中、低给药组);每组8-10只。 药品制备:药品溶解生理盐水或PBS等缓冲盐溶液 给药方式:连续给药;1-2次/天;(ig,ip,iv)14天以上 评价指标:观察记录荷瘤小鼠的存活天数(30天)(7天死亡率20%或20%动物存活超过4周,实验失败对照组存活时间14-20天) 数据处理: 生命延长率(%) 治疗组存活天数对照组
5、存活天数对照组存活天数 非腹腔给药生命延长率50% 腹腔给药75%,x100%,. 实体瘤动物模型,1)动物移植性肿瘤,常用小鼠、大鼠实体瘤动物模型表(细胞株及动物),国内外推荐模型,肿瘤移植方法:,1)无菌操作2)接种部位:右前肢腋下3)癌块的制备及接种接种710天小鼠处死,酒精消毒,切开皮肤取出肿瘤块,置于生理盐水中,冰块上保存。剪碎瘤块成2-3 mm3的小块或组织块匀浆成细胞悬液,接种到右前肢腋下。5天左右,小鼠出现瘤块即为造模成功。,7天后对照组20%小鼠肿瘤小于400 mg或大于2g,实验失败,给药及药效评价:,给药方式:连续给药;1-2次/天;(ig,ip,iv)10-12天 评价
6、指标:记录小鼠的体重变化。12天后,处死小 鼠,拨瘤称重(对照组瘤重1 g左右)。 取脾脏和胸腺称重,并测定脾细胞数目 数据处理: 抑瘤率(%) 对照组瘤重治疗组瘤重对照组瘤重抑瘤率30% 认为有效,x100%,)人癌异种移植模型,细胞:人源肝癌,胃癌,肺癌,结肠癌等肿瘤细胞动物: 裸鼠 (nude mice)特点: 1)裸体,行似无毛;2)不能执行正常T细胞功能,免疫力低下3)B细胞功能正常,NK细胞活性高,T淋巴功能缺陷 先天性无胸腺小鼠11号染色体上隐性突变裸基因(nu),肿瘤移植和给药方法:,1)无菌操作2)接种部位:背部3)细胞悬液的制备及接种细胞悬液浓度1x108/mL,接种0.1
7、mL到背部。7天左右,瘤块达到50 mm3体积即为造模成功,开始给药。4)给药时间:根据药效确定,一般12-60天。,阳性药,5-Fu (5-氟尿嘧啶)ADM (阿霉素)Taxol(紫杉醇)CTX(环磷酰胺)选择性对照药推荐剂量:1-20 mg/kg 给药方式:与测试药物相同;常隔天给药,药效评价:,评价指标:记录小鼠的体重变化。结束治疗后,处死小鼠,拨瘤称重(对照组瘤重1 g左 右)。取脾脏称重,并测定脾细胞数目。 数据处理: 抑瘤率(%)对照组肿瘤体积治疗组肿瘤体积对照组肿瘤体积抑瘤率30% 认为有效,x100%,抗肿瘤谱,Taxol(卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、头颈癌、食管癌、淋巴瘤)
8、5-Fu(乳腺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、肝癌、宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌和头颈部肿瘤) ADM( 乳腺癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤和皮肤癌),沙蟾毒精的体内抗肿瘤作用(Carcinogenesis, 2013, 34:1331),三、细胞水平的筛选,1. 抑制肿瘤细胞增殖实验 2. 诱导肿瘤细胞分化实验 3. 诱导肿瘤细胞凋亡实验 4. 抗肿瘤血管生成实验 5. 肿瘤多药耐药性逆转实验 6. 抗肿瘤侵袭和转移实验 7. 诱导肿瘤细胞自噬实验,细胞株的选择,. 抑制肿瘤细胞增殖实验,A) 噻唑兰实验(MTT) 原理:活细胞线粒体中脱氢酶能够代谢还原黄色的MTT,生成蓝紫色不溶于水的甲臜(Form
9、azan)。甲臜的多少可以用酶标仪在570 nm 处进行测定。甲臜生成量与活细胞数成正比,因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目。,MTT 原理示意图,甲臜生成量正比于活细胞数 采用比色法(570 nm)测定甲臜生成量,实验方法,1)细胞培养培养液:RPMI 1640、DMEM、MEM、 M199、McCoys5A等血清: FBS、NBS、抗生素:青霉素、链霉素、庆大霉素、新生霉素等胰酶: Trypsin-EDTA 、Collagenase缓冲液: PBS、HBSS等生长因子:EGF、B-27、N-2等,2)细胞传代贴壁细胞生长3-5天,80%融合度。用胰酶消化1-3 min后,离心,调节适
10、当密度重新悬浮在培养液中。3)细胞计数细胞计数板,5)细胞接种3000-10000细胞接种在96孔板,贴壁24小时,或对数生长期6)加药处理72 h(指定时间点)7)MTT溶液(5 mg/ml) ,孵育2-4小时8)弃去培养液,加入DMSO溶解生成的 甲臜9)酶标仪测定OD值,结果处理:,肿瘤细胞生长 抑制率(%),=,( OD对照-OD实验),OD对照,X 100%,根据生长抑制的量效曲线求出IC50 值,肿瘤细胞存活率(%)=,OD实验,OD对照,X 100%,A,B,问题:根据上图中细胞生长抑制曲线,判断化合物A和B哪一个具有较好的肿瘤生长抑制作用?,)磺酰罗丹明B (SRB)实验,原理
11、: SRB是粉红色的氨基甲氧杂蒽类化合物,是蛋白结合染料,与蛋白质的碱性氨基酸结合后呈粉红色,用酶标仪测定其吸光度。细胞中的蛋白含量与吸光度成正比,因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目和活性。,方法: 类似于法,10-20%三氯乙酸固定1 h 后,加入0.5-1%染色30 min,洗去染料,空气干燥后,加入10 mM Tris 溶解后,50 nm测定光密度结果处理:同法,)细胞排染法(酞酚蓝),原理:细胞损伤或死亡后细胞膜完整性被破坏,正 常细胞排染,而死亡细胞染成蓝色。,伊红、苯胺黑 等染料,细胞死亡率 (%),对照组活细胞数给药组活细胞数,对照组活细胞数,X100%,=,结果:,方法:
12、 细胞悬液加入酞酚蓝染色液混匀,用细胞计数板,分别计数活细胞(未染色)和死细胞数目(蓝色),. 诱导肿瘤细胞分化实验,NBT还原法原理:硝基蓝四氮唑兰(NBT) 还原法测定细胞株分化诱导。正常的中性粒细胞内磷酸戊糖支路活跃, 细胞内还原型辅酶含量增加, 将可溶性NBT还原为不溶性蓝紫色颗粒, 而沉积于细胞浆内。 方法:HL-60 细胞株是筛选分化诱导剂的,药物作用后, 细胞形态向粒细胞方向分化。 结果:显微镜计数NBT还原阳性细胞,计算诱导分化率,对照组,药物处理组,. 诱导肿瘤细胞凋亡实验,)形态学观察(透射电镜)原理:细胞超微结构观察 方法:药物处理后,收集细胞,4%戊二醛固定2 h以上,
13、PBS清洗,1%俄酸固定1 h,酒精丙酮梯度脱水,环氧树脂包埋,切片做成铜网,经醋酸铀、枸橼酸铅染色,透射电镜下观察拍照。,对照组,凋亡细胞,正常细胞胞质散在内质网、核膜清楚、染色质均匀、核仁明显。,凋亡细胞染色质浓缩、致密,沿核分布形成新月体状,有凋亡小体出现。,对照组,坏死,线粒体肿胀,凋亡细胞胞质出现明显的线粒体肿胀。,坏死细胞细胞膜不完整,核膜破裂,染色质呈虫蚀状溶解。,B)DNA形态观察(Hoeschst333258)原理: Hoeschst333258与DNA特异性结合发出蓝色荧光 方法:肿瘤细胞用Hoeschst333258染色后,在荧光显微镜下观察 结果:活细胞成均匀的淡荧光,
14、调亡细胞核或细胞质内可见强荧光的颗粒状物质。,对照组,药物处理组,C)染色体断裂测定,原理:凋亡细胞内源性核酸酶激活,链被切割成200 bp不同倍数的片段,将这些片断进行电泳,可观察到梯带 方法:裂解肿瘤细胞,消化蛋白,提取,上凝胶电泳,染色后,灯下观察。 结果:凋亡细胞显示梯带。,CTL,DRUG1,DRUG2,MARKER,)PI/Annexin-FITC双染色分析,原理:调亡细胞磷脂酰丝氨酸(PS)暴露于细胞表面,PS结合标记荧光素FITC的Annexin-V但细胞膜仍然完整,荧光染料不能进入,而调亡晚期的细胞可同时受Annexin-V和PI的双标记。 方法:肿瘤细胞同时加入Annexi
15、n-和染色,用流式细胞仪分析。,正常细胞 Annexin-V (-) PI (-),晚期凋亡细胞 Annexin-V (+) PI (+),早期凋亡细胞 Annexin-V (+) PI (-),Annexin-V,PI,PI/AnnexinV-FITC 双染激光共聚焦分析结果,PI红色荧光细胞核,AnnexinV-FITC 绿色荧光 细胞膜,Annexin-V-FITC,PI,对照组,药物处理组,. 抗肿瘤血管生成实验,肿瘤发生、生长和转移与新生血管形成密切相关,当肿瘤直径超过2 mm时,直接由微环境提供的营养就不能满足其生长需要,此时肿瘤的生长依赖于新生血管运送营养物质。肿瘤血管生成抑制剂
16、能抑制血管生成,阻止肿瘤生长和转移,在治疗肿瘤中具有高效、广普、副作用小、不易产生耐药性等优点。,)血管内皮细胞体外筛选模型,原理:体外培养的血管内皮细胞在含生长因子条件下能形成细胞条索,然后形成管状。肿瘤血管生 成抑制剂能抑制细胞管腔的形成。 方法:人脐静脉血管内皮细胞在含有药物和不含有TAI 药物的胶原凝胶中分别培养后,在显微镜下比较它们形成的管腔数目。,对照组,药物处理组,)鸡胚绒毛尿囊膜血管新生模型,原理:鸡卵在胚胎发育过程中,尿囊膜上的血管生长很旺盛,将不同药物作用于尿囊膜,观察该膜上的血管生长。方法:鸡胚胎放在直培养皿内, 在无菌恒温箱中孵育到第9 天的生长高峰时,将浸泡过药物 的明胶海绵置于鸡胚绒毛尿囊膜表面,培养天,在显微镜下随机取几个视野点,记数“热点”区的新生血管数,计算平均值。,