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1、分子生物学技术鉴定葡萄酒酵母的方法应用综述,LOGO,Part 1,葡萄酒的概念,按照国际葡萄酒组织的规定，葡萄酒只能是破碎或未破碎的新鲜葡萄果实或汁完全或部分酒精发酵后获得的饮料，其酒精度一般在8.5到16.2之间；按照我国最新的葡萄酒标准GB15037-2006规定，葡萄酒是以鲜葡萄或葡萄汁为原料，经全部或部分发酵酿制而成的，酒精度不低于7.0%的酒精饮品。,葡萄酒有许多分类方式。以成品颜色来说，可分为红葡萄酒、白葡萄酒及粉红葡萄酒三类。其中红葡萄酒又可细分为干红葡萄酒、半干红葡萄酒、半甜红葡萄酒和甜红葡萄酒，白葡萄酒则细分为干白葡萄酒、半干白葡萄酒、半甜白葡萄酒和甜白葡萄酒。,Part
2、2,功能效用,3）对脑血管疾病，如中风等有降低发病率的效果。,1)增加生活情趣以葡萄酒佐餐可以使用餐速度放慢,心情自然比较轻松愉悦,2)可减少25%-45%的心肌梗塞发病率。,4）含有能消除脂肪的单宁，可使血液保持弱碱性，强化微血管让皮肤维持柔嫩弹性。,6）每日饮用适量葡萄酒的老人，其精神与智力反应，比滴酒不沾或酗酒的老人佳。,5）葡萄酒能补充铁质，预防骨质疏松。,Part 3,红酒的制作工艺,以红葡萄酒的制作为例 第一，去梗 第二，压榨果粒 第三，发酵 其他葡萄酒的制作程序相差不多，主要在选择品种和发酵两个程序上有所不同。,Part 3,葡萄酒相关酵母菌的分子生物学鉴定方法及研究进展,图示,
3、线粒体DNA限制性酶切分析,DNA限制性片段多态性分析,随机扩增多态性DNA,图示,脉冲电泳核型分析（PFGE）,核糖体DNA 序列分析,其他分子鉴定方法,该法根据不同酵母菌种具有种内独特的mtDNA限制性图谱，通过比较各自的酶切物理图谱，根据限制性片段在不同群体中的共享度计算遗传距离，该法适用于近缘种群间的鉴定或种内群体的比较1。,线粒体DNA 限制性酶切分析,2000 年，Giuseppe Comi等人利用mt DNA-RFLP 分析对意大利Collio地区本土酿酒酵母种内生物多样性进行评价，显示本土酿酒酵母的遗传多样性2。 2002 年，Josepa Sabate 等人，从西班牙Prio
4、rat 产区葡萄酒厂的发酵池表面分离出了3 株酿酒酵母（S. cerevisiae）菌株，并通过mt DNA-RFLP 的方法描述了这3 株菌株的种内差异3。,DNA 限制性片段多态性分析是基于DNA和分子杂交的一项技术，其特异性很强，主要依靠分析相似系数进行鉴别。对于葡萄酒相关酵母菌的鉴定来说，酵母5.8SrRNA 基因及两侧的转录间隔区（internal transcribed spacer,ITS）的PCR-RFLP使用得最为广泛 4。,DNA 限制性片段多态性分析（PCR-RFLP）,1999 年，Esteve-Zarzoso等人首次利用该DNA区域具有显著的种间差异性的特点，发现不同
5、种的酵母菌对应不同的酶切图谱，并建立了基于5.8SrDNA-ITS 的RFLP 分析的酵母菌种的数据库，并确定了5.8S-ITS 扩增片段的RFLP 分析在种的水平上鉴定酵母菌的有效性5。 2007年，西北农林科技大学苏龙等人对中国东北山葡萄酒产区山葡萄酒自然发酵过程分离得到的酵母进行5.8S rDNA基因的RFLP 分析，得到19 种酶切图谱，表现了东北山葡萄酒产区葡萄酒相关酵母的多样性6。,随机扩增多态性DNA分析,其原理是利用大约10 个碱基的随机引物以PCR 技术为基础，对整个基因组DNA 进行扩增，得到多个片断，再利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测个体间扩增出的片断的多态性，可以
6、辨别出菌株间基因组DNA内核苷酸序列存在的微小变异7。,2008 年，Barbara Bovo 等人通过RAPD 的方法对格拉巴酒酿制过程中分离出的酵母菌株进行了鉴定，将分离出的70 株菌株鉴定到了种的水平，显示了高度的生物多样性。作者还指出了RAPD 的鉴定方法的重现性达到了96 %以上8。 同年，Andrea Skelin 等人通过RAPD 的方法对克罗地亚南部分离得到的酵母属的酵母进行了分子鉴定。他们采用的是PCR-RFLP 和RAPD 相结合的方法，研究发现PCR-RFLP 只能将酵母菌鉴定到种的水平， 继而采用RAPD 的方法能鉴定到菌株的水平9。RAPD 的方法也是一种较为常用的、
7、简便的酵母菌种鉴定方法。,脉冲电泳核型分析（PFGE）,机理：相同菌种不同菌株间的染色体数、核型大小并不完全相同，存在不同程度的差异。 脉冲电场凝胶电泳可以在琼脂糖凝胶中用电泳分离完整的酵母染色体DNA 分子，从而测定酵母细胞染色体条数及其大小。大量研究表明，脉冲电泳核型分析对酵母属（Saccharomyces）的种内鉴定有着重要的贡献，并被认为是一种快速、简单、有效的鉴定方法。,2000 年，中国科学院微生物研究所白逢彦通过脉冲电场凝胶电泳分析发现酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、贝酵母(S.bayanus)和巴氏酵母(S. pastorianus)三者与少孢酵母
8、(S. exiguus) 在电泳核型上具有明显的差异，并重新为某些菌株定义了分类和种属9。 2003 年，F.Dellaglio 等人对葡萄酒自然发酵过程中分离得到的一种变种酵母（Saccharomycesbayanus var. uvarum） 和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的分子鉴定过程中也用到了脉冲电场凝胶电泳（PFGE）的方法，并且得到了较好的结果11。 2007 年，贵州大学的夏青等人通过传统分类鉴定方法和脉冲电场凝胶电泳（PFGE）相结合，鉴定出了8 株国外引进的酿酒酵母菌的种属10。,核糖体DNA 序列分析,葡萄酒相关酵母的rRNA 基因（rDNA
9、）及转录间区（ITS）的序列是鉴定过程中最为常用的，包括18S rDNA、26S rDNA 的D1/D2、ITS、5.8S rDNA。由于这些序列均能在GenBank/EMBL/DDBJ 等国际核酸序列数据库中查找到，因此通过对特定基因区域的序列比对，就能够准确地为葡萄酒相关酵母进行分类鉴定。,研究表明，26S rDNA 的Dl/D2 区域具有较高的变异率，可以用于亲缘关系较近的菌株之间的分类研究。一般同一个种的不同菌株其碱基差异一般不超过1%，而属于不同种的菌株其核苷酸序列差异一般较大， 根据这一标准，可以将绝大部分种区分开。,（1）26S rDNA D1/D2 区序列分析,2003 年，H
10、arry vanKeulen 等人也是通过这种方法，将美国Lake Erie 地区霞多丽、雷司令、灰比诺葡萄自然发酵过程中分离出的酵母属的菌株和野生酵母菌种进行了分类鉴定15。 2007 年， 西北农林科技大学徐艳文等人通过26SrDNA 的Dl/D2 区域分析的方法， 分析鉴定了自甘肃莫高葡萄酒厂分离的29 株非酿酒酵母菌，证明此方法在葡萄酿酒酵母菌种多样性研究中良好的应用价值13。 同年，中国食品发酵工业研究院的李金霞等人同样利用该分析法对中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC) 保藏的22 株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和1 株威尔酵母(S.willia
11、nus)进行了复核鉴定，结果表明，该方法能够应用于酿酒酵母的分子生物学鉴定14。,（2）5.8S-ITS rDNA 区序列分析,rDNA 中5.8S 区的长度和序列非常保守， 而ITS 区的长度和序列则变异较大；根据它们的序列差异，可以进行对葡萄酒相关酵母菌种的分类鉴定，这种方法对于亲缘关系较近的菌株间的区分也能够得到良好的效果。,2003年，Matthias 等人同样利用这种鉴定方法，对贵腐葡萄酒中的一株耐寒耐渗透性菌C.zemplinina进行了鉴定，并定义为一株新种17。5.8S-ITS rDNA 区序列分析的方法鉴定准确性很高，是葡萄酒相关酵母分类鉴定中应用最为普遍和频繁的方法。 20
12、05 年，A.A. Nisiotou 和G.R. Gibson 通过5.8SITSrDNA 区序列分析的方法对希腊市售葡萄酒中潜在的酵母进行了鉴定和检测， 并且发现这种鉴定方法快速而准确16。,其他分子鉴定方法,近年来，随着分子生物技术手段的发展，新的鉴定葡萄酒相关酵母菌种的方法也有所发展，如实时PCR 技术（Real time PCR），它是一项基于稳定遗传特性的技术，可以特异性地鉴定酵母菌种类。2007 年，Hierro 等人指出实时PCR 技术能够无需酵母菌种的预培养即可达到鉴定的目的， 是一种方便而快捷的鉴定手段18。另外，TRFLP，ARISA 及DNA 重组探针的指纹图谱技术和微卫
13、星分子标记技术对葡萄酒相关酵母菌种的鉴定也能够达到较好的效果。,Part 4,结束语,综合所述，各种分子生物学技术鉴定葡萄酒酵母的方法都有各自的优势与劣势， 要想达到满意的鉴定结果一般都需要结合两种以上的分子鉴定手段， 或是根据不同的菌种采用特定的鉴定方法。,参 考 文 献,参 考 文 献,1 雷崑,黄雅琳.壳聚糖对啤酒中嘌呤的吸附性能J.安徽农业科学,2006,34(7) : 1431. 2 Nguyen T T, Sporns P, Hadziyev D. Simultaneous liquid chromatography determination of ribonucleoside-
14、5-monophosphates and their isomers in potato tubersJ. J Chromatogr, 1986, 363:361-281. 3 Qureshi A A, Prentice N. Quantitation of potential flavoring compounds in worts and beers by HPLCJ.J .Am. Soc. Brew.Chem.1979,37(4):153-160. 4 骆锡能,陈翠瑶.水产品嘌呤含量定量方法的建立J.食品科学(台湾),1997, 24(1):1-11. 5 尤玉如,张艳萍,刘士旺.HPL
15、C 法测定啤酒中嘌呤含量的方法研究J.中国酿造,2008,3:76-79. 6 钟晓盈,陆幼兰.利用HPLC 测定啤酒嘌呤含量方法的研究J.啤酒科技,2007,3:23-26.,7丁明玉,杨海军,肖善强,等.反相高效液相色谱法直接测定茶水提取物中的嘌呤碱J.色谱,1999,17(5):459-461. 8 霍小敏,屠春燕,宋慧敏,等.HPLC法测定酵母RNA 降解的4种核苷酸J.南京工业大学学报,2002,24(4):61-64. 9Andrea SKELIN, Sanja SIKORA, Sandi ORLI, Lejla DURAKOVI, Sulejman REDEPOVI. Genet
16、ic Diversity of Indigenous Saccharomyces sensu stricto Yeasts Isolated from Southern CroatiaJ. Agriculturae Conspectus Scientifi cus,2008,73 (2):89-94. 10白逢彦, 贾建华. 脉冲电泳核型分析在酿酒酵母菌分类学研究中的应用J.微生物学报, 2000, 40:9-13. 11夏青,谢田,文红梅,刘永翔. 8株国外引进的酿酒酵母菌的分类鉴定J.贵州农业科学,2007,35(2):15-19. 12F.DELLAGLIO,.G.ZAPPAROLI, P.MALACRIN, G.SUZZI,S.TORRIANI.Saccharomyces bayanus var. uvarum and Saccharomyces cerevisiae succession during spontaneous fermentations of Recioto and Amarone wines.,
