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1、第5章 分子生物学研究方法(上),内容： 重组DNA技术回顾 DNA基本操作技术 RNA基本操作技术 SNP的理论与应用 基因克隆技术 蛋白质组与蛋白质组学技术,敬请期待刘宝全老师的精彩讲解!,DNA解链(变性)、引物与模板DNA相结合(退火)、DNA合成(延伸),聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR),多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA数，即两条引物位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值是2n。,实时荧光定量PCR技术的原理及应用 (Real time Quantitative PCR),实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法
2、介绍,于1996年由美国Applied Biosystems公司推出,实时荧光定量PCR定义,在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法,实时荧光定量PCR 原理,常 规 PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。,实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析,实时荧光定量PCR原理,三个概念：扩增曲线、荧光阈值、Ct值,如何对起始模板定量？,通过Ct值和标准曲线对起
3、始模板进行定量分析,实时荧光定量PCR原理,Cycle（循环数）,Rn（荧光强度）,Baseline,Lgliner phase,前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline）荧光阈值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段真正的信号:荧光信号超过阈值,Threshold,平台期,实时荧光定量PCR原理 -荧光阈值,实时荧光定量PCR 原理 -Ct值,Ct值的定义：(Cycle threshold)PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。,实时荧光定量PCR 原理 -Ct值的
4、重现性,Ct值的特点： 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性,实时荧光定量PCR 原理 - 定量原理,理想的PCR反应：X=X0 2n 非理想的PCR反应：X=X0 (1+Ex)nn：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率,实时荧光定量PCR 原理 - 定量原理,在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得:log M=log X0 (1+Ex)Ct (2)整理方程式(2)得:log X0=
5、- log(1+Ex) *Ct+ log M (3) Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量,荧光强度-循环数曲线,初始模板量对数-C(T)循环数标准曲线,104,103,106,105,102,10,初始模板量越多，C(t)值越小 C(t)与初始模板浓度的对数值成线性关系,实时荧光定量PCR 原理 - 标准曲线,确定未知样品的 C(t)值 通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量,实时荧光定量PCR原理-绝对定量,实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR实验设计及应用,非特异性荧光标记：1、 SY
6、BR Green 特异性荧光标记：2、TaqMan3、Molecular Beacon,实时荧光定量PCR 原理 - DNA 产物的荧光标记,实时荧光定量PCR 方法 1 -SYBR Green 法,SYBR Green能结合到双链DNA的小沟部位,SYBR Green只有和双链DNA结合后才发荧光变性时，DNA双链分开，无荧光复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。,SYBR Green,SYBR Green 工作原理,实时荧光定量PCR原理 SYBR Green 熔解曲线分析,Tm值：DNA解链一半时的温度,实时荧光定量PCR原理 SYBR Gre
7、en 熔解曲线分析,将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT),Tm,实时荧光定量PCR原理 SYBR Green 熔解曲线分析,SYBR Green 法 定量原理,Cycle number,模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量,SYBR Green 法 -PCR反应的建立,反应体系的建立及优化: SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测 Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物 反应Buffer
8、 体系的优化 反应温度和时间参数:由酶和引物决定 其他与常规PCR相同,SYBR Green 法 应用范围,起始模板的测定基因型的分析融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。,SYBR Green 法 优缺点,实时荧光定量PCR 方法2 -TaqMan法,TaqMan-水解型杂交探针,5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q)探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光Taq酶有 53外切核酸酶
9、活性，可水解探针,TaqMan法 工作原理,每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光,TaqMan 法 PCR反应的建立,1、引物、探针的设计：探针Tm为68-70 ，30 bp, 5不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp，引物Tm为59-60 2、反应参数的确定：一般为：94 ，10-20S60，30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高）也可通过温度梯度优化退火温度72 ，45 S， 3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值引物浓度：50-900nM探针浓度：50-250nM 4、其他与常规PCR相同,
10、TaqMan法 检测血液中的HBV,乙肝病人血液中HBV的绝对定量 目的：利用核酸检测，缩短检验时间，提高灵敏度，为诊断用药提供依据 方法：从血液中提取病毒DNA，扩增病毒基因，以TaqMan探针进行检测 设置对照：浓度为106、105 、104 103 的标准样品各一个，设阴性和空白对照 实验步骤：提取HBV DNA设计特异引物设计TaqMan探针并标记探针扩增程序 结果：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数,TaqMan法 检测血液中的HBV,数据分析,分析结果： HBV DNA的精确copy数为3.7 8 105,TaqMan法 应用范围,起始模板的定量基因型分析目的基因定量产物
11、鉴定SNP分析,TaqMan法 优缺点,实时荧光定量PCR 方法 3- Molecular beacon 法(分子信标),标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补 茎由互补配对序列组成,发夹型杂交探针,实时荧光定量PCR的分类分子信标,Molecular beacon (分子信标) 工作原理,荧光共振能量转移（FRET）探针与DNA杂交时产生荧光-变性过程：产生非特异性荧光-退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号-延伸过程：不产生荧光,Molecular beacon的应用范围,起始模板的定量基因型分析产物鉴定SNP分析,Molecular beacon优缺点,2.7.1 SNP 的概述,单核苷酸
12、多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)，指由于单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性。在不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大多数核苷酸序列一致而只有一个碱基不同的现象，即SNP。在群体中的发生频率不小于1 %。,2.7 SNP的理论与应用,SNP概念,包括单个碱基的转换、颠换、插入和缺失等 转换是指同型碱基之间 G-A,T-C 颠换是指发生在嘌呤与嘧啶之间A-T、A-C、C-G、G-T 但事实上，转换的发生频率占多数,而且是C-T 转换为主其原因是Cp G的C 是甲基化的,容易自发脱氨基形成T,SNP发生频率 在动物基因组中分布广泛
13、 如果随即抽取两个人的基因组对比,大概1000个碱基就会出现一个SNP,SNP 的特点,（1）密度高 SNP在人类基因组的平均密度估计为 1/1000 bp , 在整个基因组的分布达 3106个。 （2）富有代表性 某些位于基因内部的SNP 有可能直接影响蛋白质结构或表达水平, 因此, 它们可能代表疾病遗传机理中的某些作用因素。 （3）遗传稳定性 与微卫星等重复序列多态性标记相比, SNP 具有更高的遗传稳定性。 （4）易实现分析的自动化 SNP标记在人群中只有两种等位型(allele) 。这样在检测时只需一个“ + - ”或“全无”的方式,这使得基于SNP的检测分析方法易实现自动化。,SNP
14、分类,基因编码区SNP（cSNP）同义cSNP：SNP所导致的编码序列改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基和未突变碱基的含义相同。非同义cSNP：碱基序列的改变可以使其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响蛋白质的功能。 基因调控区SNP （pSNP） 基因间随机非编码区（rSNP）,SNP可以由单核苷酸的转换或颠换引起。 1) 绝大多数SNP为中性变异，并不对基因组功能造成影响，只是作为遗传标记而存在。 (2)对基因功能直接存在影响的SNP存在两种情况：一种是SNP的存在使氨基酸编码造成改变，从而使表达的蛋白有序列上的改变，并引起该蛋白的结构、活性或稳定性的变化；另一种是SN
15、P的存在使表达的蛋白在量上发生了改变，并对机体的正常生理活动产生影响。,SNP的功能,2.7.2 SNP的检测技术,基于以下9 种基本原理: 以结构为基础; 限制性片段长度多态性法 （RFLP ）; 单链构象多态性法 （SSCP ）; 变性梯度凝胶电泳 （DGGE ）;等位基因特异PCR（AS-PCR）; RT-PCR; 等位基因特异性杂交; 引物延伸法-单碱基延伸法; DNA直接测序法;飞行质谱仪 (MALDI- TOFMS )检测;变性高效液相色谱 ( DH PLC )法；,SNP检测技术,基因芯片 Taqman 技术 分析信标 焦磷酸测序,2. Taqman 技术原理,每检测一个SNP 位点需要一条探针,3. 分子信标技术,分子信标由称为“茎”(stem)和“环”(loop) 的两部分构成，茎部分是由寡核苷酸探针两端互补的序列形成的，又可称之为手臂，环则是探针的中间部分,其序列和待扩增的目的片段互补并含有要检测的SNP 位点。,
