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1、第七章免疫学检测技术,免疫学检测技术以其灵敏度高、专一性 强和速度快等显著特点广泛用于食品的品 质、质量、安全以及食品中生物活性成分的 检测与分析。,第一节抗原抗体的检测,一.抗原抗体反应,指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合 反应，是免疫球蛋白分子上的抗原结合位和抗 原分子上的抗原决定簇相互吸引以及多种分子 间的引力参与下发生的反应。抗原抗体反应可 发生于体内，也可发生于体外。,抗原,抗体,抗原与抗体之间通过非共价键结合，它们之间的结合力包括电荷引力、范德华力、氢键结合力和疏水作用力。多种非共价结合力使抗原抗体紧密结合在一起。,抗原与抗体结合力,抗原与抗体反应特点,抗原,抗体,1、特异性：
2、抗原抗体在化学结 构和空间构型上呈互补关系， 两者结合具有高度特异性。 2、按比性：两者分子比例合适 时才出现最强的反应。 3、可逆性：改变pH和离子强度 是最常用的促解离方法。,抗原与抗体反应的影响因素,1）抗原抗体性质：互补程度 2）酸碱度：pH 6-8温度：37 度 电解质：0.85%氯化钠或各种缓冲液,二.利用抗原抗体反应的实验,主要用途： 用已知的抗体检测未知的抗原。 用已知的抗原检测未知的抗体。 定性或定量检测体内各种大分子，如：细胞因子，免疫球蛋白。,二.利用抗原抗体反应的实验,免疫凝集试验 免疫沉淀反应 免疫标记技术 其他,1.免疫凝集试验,颗粒抗原(例；细菌、红细胞）或可溶性
3、抗原结 合于不容性载体微粒上后与相应的抗体在适当的 条件下，经一定时间后凝集成肉眼可见的凝集物。,直接凝集反应,间接凝集反应,免疫凝集反应,颗粒抗原,相应抗体,直接凝集反应,颗粒抗原(例；细菌、红细胞）与相应的抗体直接结 合所出现的凝集现象称为直接凝集反应。,直接凝集反应,肉眼可见的凝集物,直接凝集试验,试管法,玻片法,将可溶性抗原（或抗体）先吸附于一种与免疫无关 的、一定大小的颗粒状载体的表面，然后与相应的抗 体(或抗原)作用，在有电解质存在的适宜条件下，即 可发生凝集，称为间接凝集反应。 载体：人或动物的红细胞、活性碳颗粒、聚苯乙烯胶 乳等。 载体增大抗原（或抗体）反应面积。,间接凝集反应
4、,可溶性抗原,不容性载体,相应抗体,正向间接凝集反应,可溶性抗体,不容性载体,可溶性相应抗原,反向间接凝集反应,2.免疫沉淀反应,免疫沉淀反应（precipitation）是指可溶性抗原 （细菌培养液、细胞或组织浸出液、血清蛋白等） 与相应抗体特异结合后，在电解质参与下出现的沉 淀现象。该反应多用于半固体琼脂作为介质，抗原 抗体在凝胶中扩散，在比例合适处形成白色沉淀。,单向免疫扩散,单向免疫扩散（single immunodiffusion) 将一定量的已知抗体均匀混于琼脂凝胶中 制成琼脂板，在适当位置打孔后加入抗 原。孔内抗原向四周呈环状形成浓度梯 度，在抗原与抗体的量达到一定比例时即 可形
5、成肉眼可见的沉淀环。,抗原,抗体,双向免疫扩散,双向琼脂扩散（double immunodiffuse test)可溶性 抗原和抗体在含有电解质的同一个琼脂凝胶板的对应 孔中，各自向四周凝胶中扩散，如果两者相对应，则 发生特异性反应，在浓度比例合适处形成肉眼可见的 白色沉淀线。本法常用于抗原或抗体的定性检测、组 成和两种抗原的相关性分析。,常用于食品安全检测，对食品中污染病源菌的定性和监别，以及食品中的某些成分。如：单向免疫扩散法检测牛乳中免疫球蛋白含量。,免疫沉淀试验应用,3.免疫标记技术,免疫标记技术immunolabelling technique 指用荧光素，放射性核素，酶、化学发光剂
6、 等作为追踪物，标记抗体或抗原进行的抗原 抗体反应。具有灵敏度和特异性高，快速， 可定性、定量等检测。,免疫标记技术分类,酶标记免疫学分析EIA 放射线标记免疫学分析RIA 免疫荧光法IF,酶标记免疫学技术,将酶催化作用的高效性与抗原抗体的特异性相结 合的一种微量分析技术。酶标记抗原或抗体后形成的 酶标记物，既保留抗原或抗体的免疫活性，又保留了 酶的催化活性。当酶标记物与待测标本中相应的抗原 或抗体相互作用时，可形成酶标记抗原抗体复合物。 利用复合物上标记的酶催化底物显色，其颜色的深浅 与待测标本中抗原或抗体的量相关。灵敏度：ng-pg, 常用酶:辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶,酶标记免疫学技术,
7、酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) 免疫印迹技术(Immuno-blotting) 酶免疫组化技术（enzyme immunohistochemistry technique) 其它,ELISA : enzyme linked immunosorbent assay将已知抗体（抗原）包被于载体上，再加上抗 原-抗体反应使酶标记抗体（抗原）结合在载体上， 经洗涤去除游离的酶标记抗体（抗原）后加入底 物显色，定性或定量分析有色产物确定待测物 的存在与含量的检测技术。,酶联免疫吸附试验（ELISA),酶联免疫吸附试验（ELISA),间
8、接法 双抗体夹心法 竞争法,酶联免疫吸附试验（ELISA),间接法,抗原,抗体一抗,二抗,底物,产物,酶联免疫吸附试验（ELISA),双抗体夹心法（三明治),抗原,抗体,酶标抗体,底物,产物,酶联免疫吸附试验（ELISA),竞争法,E,E,E,E,E,E,E,E,E,E,E,E,测定,对照,抗原,底物,产物,抗体,E,酶标抗原,ELISA广泛应用于食品科学领域。,食品中农药残留检测 食品中抗生素残留检测 食源性病原菌检测,食品安全检测,食品成分提取,功能性食品研究,免疫印迹技术(Immuno-blotting),将凝胶电泳的高分辨力同固相免疫测定结 合起来的一种方法。先将复合物在分离胶中分 离
9、，然后将这些分子转移至膜上，再用特异性 的抗体来鉴定这些单个的抗原成分。,免疫印迹技术(Immuno-blotting),SDS-PAGE蛋白质转印酶免疫测定,可应用于蛋白质提取及分析等许多方面。,三项技术结合而成。,免疫印迹技术(Immuno-blotting),CBB,Immunoblotting,LWPC,LWPC,酶免疫组化技术,以酶标抗体与组织或细胞的抗原进行反应，结合形态学检查，对抗原进行定性、定量或定位检测的技术。用于测定组织或细胞表面的抗原。,3.免疫标记技术,酶标记免疫学分析EIA 放射线标记免疫学分析RIA 免疫荧光法IF,放射线标记免疫学分析RIA,用放射性同位素标记抗原
10、或抗体进行免疫 学检测的免疫标记技术。该法灵敏度高达pg。 常用的放射性同位素有125I 和 131I。应用于食品安全检测，食品中农药残留、 激素等检测。,免疫荧光法IF,直接法荧光素直接标记抗体，对标本进行检测。,特异性强，但任一抗原均需制备荧光素抗体,间接法用第一抗体与标本中抗原结合，再用荧光素 标记的二抗进行检测。灵敏度高、荧光素标记的二抗 可用于多种抗原的检测，但非特异性荧光增多。,第二节淋巴细胞的测定,测定淋巴细胞的功能，可以判断机体的细 胞免疫或体液免疫水平。测定淋巴细胞功能试验应用于功能性食品 等研究中。,T淋巴细胞增殖试验,T细胞功能测定,细胞毒试验,T淋巴细胞增殖试验,T淋巴
11、细胞在有丝分裂原或抗原刺激下可转化 为淋巴母细胞，产生一系列形态变化。细胞变 大、细胞浆增多、出现空泡、核仁明显、核染色 质疏松等。,T淋巴细胞增殖试验,形态学方法-镜检淋巴母细胞 3H-TdR掺入法氚标记胸腺嘧啶核苷（Thymidine ribosode)渗入法。测定DNA增殖的量(也可用于测NK细胞活性) MTT比色法细胞活化增殖水平（可溶性噻唑盐，代谢后产生兰紫色物）,T淋巴细胞增殖试验,T淋巴细胞增殖试验,根据形态结构，计算淋巴细胞转 化率，即淋巴母细胞的含量,形态学方法,淋巴细胞转化过程中，细胞DNA合成大 量增多。在细胞培养液中加入氚标记的胸 腺嘧啶核苷（ 3H-TdR ），使3H
12、-TdR渗 入到DNA中，根据细胞内核素的量可判断 淋巴细胞转化程度。,3H-TdR掺入法,MTT比色法,MTT是一种黄色可溶性噻唑盐，掺入细 胞后，在细胞活化增殖时通过线粒体能量 代谢过程，MTT代谢形成蓝紫色甲瓒沉积 于细胞内或细胞周围，形成的甲瓒的量与 细胞活化增殖的程度成正相关。,细胞毒试验,细胞毒试验,乳酸脱氢酶法,细胞凋亡检查法,乳酸脱氢酶法LDH在胞浆内含量丰 富，正常时不能通过细胞膜，当细胞受 损伤或死亡时可释放到细胞外，此时细 胞培养液中LDH活性与细胞死亡的数目 成正比，用比色法测定。,乳酸脱氢酶法,细胞凋亡检查法靶细胞被CTL 杀伤后，可发生细胞凋亡。方法有形 态学法、琼
13、脂糖凝胶电泳、流式细胞 仪等。,细胞凋亡检查法,B细胞功能测定,B细胞的数目和功能测定是反应机体体液 免疫水平的重要指标。,抗体形成细胞试验,用绵羊红细胞（SRBC）免疫家兔或小鼠，取 家兔淋巴结或小鼠脾脏制成细胞悬液，与高浓度 的SRBC混合后加入琼脂糖凝胶中，其中每个释 放溶血性抗体的细胞可致敏其周围的SRBC ，在 补体参与下，抗体形成细胞周围SRBC溶解，在 其周围形成一个肉眼可见的空斑。一个空斑代表 一个抗体形成细胞，空斑数量反应机体的体液免 疫功能。,举 例,增强免疫力的功能性食品的研究,1.乳果糖低聚体促进肠粘膜IgA的分泌 2.具有促进IgA产生的食用蘑菇的探索 3.LF、b-LG增强淋巴细胞产生抗体 4.Lf促进IL4的产生 5. b-LG促进IFN的产生 6.大豆胰蛋白酶抑制剂增强脾淋巴细胞产生IgM,7.调节肠Caco-2细胞产生IL-8的食品成分的研究 结果；薄荷抽提物具有促进IL-8分泌的作用。,降低过敏性的食品研究,1.具有抗过敏性的乳酸菌株的选拔 2.具有抗过敏性的甜茶成分的分析 3.降低卵白蛋白刺激引起的IgE抗体水平的乳酸菌株的研究 4.降低b-LG免疫xing deyanjiu,
