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1、分子生物学研究方法 专题二 目的蛋白的获得及其功能研究孙素荣 （13319862533） sr_,本课程以专题形式开设，分为6个专题 1.目的基因的获得及其功能研究 2.目的蛋白的获得及其功能研究 3.核酸相互作用研究 4.核酸与蛋白质相互作用研究 5.蛋白质相互作用研究 6.小分子物质与生物大分子的相互作用研究,一、目的蛋白的获取和纯化二、从基因到蛋白相关的检测分析技术（一）（二）三、蛋白组学研究内容及方法,一、目的蛋白的获取和纯化天然蛋白重组蛋白蛋白质分离纯化的一般步骤和原则蛋白样品的制备常用的蛋白分离技术重组蛋白纯化需要注意的一些问题,天然蛋白1.已知蛋白（得到已明确功能的蛋白）（特定活
2、性跟踪，亲和层析，N端测序，结构分析，结构改造）2.未知蛋白（带有某种功能的蛋白）（活性跟踪法,从cDNA文库中获取 基因重组重组蛋白 目标蛋白）,如何获得重组蛋白？（目的是对目标蛋白进行分析） 获得目的基因（多以多聚酶链反应PCR扩增技术基因片段经体外DNA重组后转化受体细胞，使其表达特定蛋白。,重组蛋白,基因文库 Gene Library,基因组DNA文库 (genomic DNA library) cDNA文库(cDNA library),基因文库(gene library),是指一个包含了某一生物体全部DNA信息或RNA信息的克隆群体。,一、基因组DNA文库,基因组DNA文库是指生物的
3、基因组DNA的信息（包括所有的编码区和非编码区）以DNA片段形式贮存的克隆群体。,用于构建基因组文库的载体有噬菌体、粘粒和酵母人工染色体等。,基因组文库和cDNA文库的构建和筛选,cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经逆转录而合成的cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。,二、cDNA文库,自20世纪70年代中期首例cDNA克隆问世以来，构建cDNA文库已成为研究功能基因组学的基本手段之一。由于cDNA不像基因组DNA含有内含子而难于表达，因此可以从cDNA文库中筛选到所需的目的基因，并直接用于该目的基因的表达。 通过构建cDNA
4、表达文库 可以提供构建分子标记连锁图谱的所用探针； 可以用于分离全长基因进而开展基因功能研究 而cDNA文库具有组织细胞特异性，使得它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，因此成为了研究工作中最常使用到的基因文库。,基因组文库和cDNA文库的构建和筛选,cDNA 文库构建的基本原理与方法,cDNA 文库是某生物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。 经典 cDNA 文库构建的基本原理：用 Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头
5、，连接到适当的载体中获得文库。,cDNA 文库构建的基本步骤包括：,1.RNA 的提取 要构建一个高质量的 cDNA 文库，获得高质量的 mRNA 是至关重要的，所以处理 mRNA 样品时必须仔细小心。由于 RNA 酶存在所有的生物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建立一个无 RNA 酶的环境对于制备优质 RNA 很重要。,2.用反转录酶 Oligo(dT) 引导下合成 cDNA 第1链， cDNA 第2链的合成(用 RNA 酶 H 和大肠杆菌 DNA 聚合酶 I，同时包括使用 T4 噬菌体多核苷酸酶和大肠杆菌 DNA 连接酶进行的修复反应)，合成接头的加入、将双链 DNA 克隆到载体
6、中去；3.分析 cDNA 插入片断，扩增 cDNA 文库、对建立的 cDNA 文库进行鉴定。 对载体的选择，常规用的是 噬菌体，这是因为 DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可用来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳大片段的外源 DNA。,cDNA 全长文库,全长 cDNA 文库，是指从生物体内一套完整的 mRNA 分子经反转录而得到的 DNA 分子群体，是 mRNA 分子群的一个完整的拷贝。 全长 cDNA 文库不仅能提供完整的 mRNA 信息，而且可以通过基因序列比对得到 mRNA 剪接信息，此外，还可以对蛋白质序列进行预测及进行体外表达和通过反向遗传学研究基因的功能等。 目前所报道的对全长
7、文库的构建一般按照美国 CLONTECH 公司的 SMART cDNA Library Construction Kit 方法或 GeneRacer 试剂盒 (Invitrogen，USA) 使用说明进行。,判断一个 cDNA 文库中的 cDNA 序列是否是全长基因的 cDNA，主要方法有以下几种：,1 直接从序列上评价 5端：通过与其它生物已知的对应基因5末端进行同源全长基因的比较。如果无同源基因的新基因，则首先判断编码框架是否完整，即在开放阅读框的第1个 ATG 上游有无同框架的终止密码子；其次，判断是否有转录起始点。3端：用其它生物已知的对应基因3末端进行比较来判断，或编码框架的下游有终
8、止密码子，或有1个以上的 PolyA 加尾信号，或无明显加尾信号的则也有 PolyA 尾。 2 用实验方法证实 可以通过引物延伸法确定5端和3端的长度，如：5端 RACE，3端 RACE，或者通过 Northern Blot 证实大小是否一致。,对 cDNA 文库的分析,1.文库的代表性cDNA 文库的代表性是指文库中包含的重组 cDNA 分子反映来源细胞中表达信息(即 mRNA 种类)的完整性，它是体现文库质量的最重要指标。文库的代表性好坏可用文库的库容量来衡量，它是指构建的原始 cDNA 文库中所包含的独立的重组子克隆数。 库容量取决于来源细胞中表达出的 mRNA 种类和每种 mRNA 序
9、列的拷贝数，1个正常细胞含1000030000种不同的 mRNA，按丰度可分为低丰度、中丰度和高丰度三种。,2.重组 cDNA 片段的序列完整性。在细胞中表达出的各种 mRNA 尽管具体序列不同，但基本上都是由3部分组成，即5端非翻译区，中间的编码区和3端非翻译区。非翻译区的序列特征对基因的表达具有重要的调控作用，编码序列则是合成基因产物蛋白质模板。因此，要从文库中分离获得目的基因完整的序列和功能信息，要求文库中的重组 cDNA 片段足够长以便尽可能地反应出天然基因的结构。,cDNA 文库构建的其它类型,1 均一化 cDNA 文库 2 差减 cDNA 文库 (Subtractive cDNA
10、library) 差减杂交的方法主要有(1)羟基磷灰石柱层析法 (HAP)；(2)生物素标记、链亲和蛋白结合排除法；(3)限制性内切酶技术相结合的差减方法；(4)差减抑制杂交法 (SSH)；(5)磁珠介导的差减法 (MAST)，其中 SSH 法最为常用。 抑制性消减杂交技术 (Suppression Subtractive Hybridization，SSH) 是 DIATCHENKO 等人于1996年依据消减杂交和抑制 PCR 发展出来的一种分离差异表达基因的新方法，主要用于分离两种细胞或两种组织的细胞中的差异表达基因。 3.固相 cDNA 文库构建,应用cDNA 文库来分离新基因的方法,分
11、离方法主要有两种： 第一，对于非全长 cDNA 文库，需要利用已经获得的新 cDNA 序列片段，通过 RACE 方法获得新基因的全长序列。RACE 法 即快速扩增 cDNA 末端法( Rapid Amplification of cDNA End，RACE )只需知道 mRNA 内很短的一段序列即可扩增出其 cDNA 的5(5 RACE )和3端(3 RACE )。 第二，利用全长 cDNA 文库与目的基因片段作为探针的杂交筛选。,实验方案 （以 Clontech公司 Creator SMART cDNA Library Construction Kit 为例）,第一阶段 1）组织材料提取总R
12、NA，分离mRNA，纯化总mRNA后，进行反转录合成cDNA第一链。 2） 通过引物延伸法进行dscDNA合成，经sfiI酶切后，经层析柱分离cDNA（回收大于500bp的cDNA）。 3） 将分级纯化的dscDNA与sfiI酶切的逆转录病毒载体pRetro-Lib（Amp抗性）连接。 4） 将重组产物转化大肠杆菌DH10B感受态细胞,第二阶段 1) 不同稀释度测定平均滴度，检测库容量（重组子克隆数目）。 2)随机挑取40个克隆子，PCR方法或sfiI酶切检测重组克隆子比例（重组率），检测平均插入片段大小。 3) 每个文库随机挑取20个克隆子抽提质粒进行双向测序，通过序列分析判断插入片段是否含
13、有全长ORF。甘油保存大肠杆菌文库 初级cDNA文库的质量分析QC(文库标准 ：库容量：110 7 cfu/ml ;平均插入片段： 1.2 kb;重组率：95%;全长基因比例：65% ),第三阶段 文库扩增 按Creator SMART cDNA Library Construction Kit进行文库扩增，并测定滴度。,EST测序 （对构建好的文库进行测序 ）,ORF预测 基因注释 功能聚类,目的基因的克隆表达（常规） 重组蛋白,表1 蛋白质物化性质和分离纯化方法 蛋白质的 分离纯化方法 物理和化 学性质 分子的大 密度梯度离心 、超滤、透析、分子筛层析 小和形状 等电点和 制备电泳、等电聚
14、焦层析（或电泳）、 电荷 离子交换层析、吸附层析等 溶解度 盐溶、盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉液液萃取技术等 与其它分子 亲和层析、金属螯合亲和层析、共价层析 的亲和性 亲疏水性 疏水层析、反相层析等 ,常用蛋白样品的制备方法,1.裂解细胞： 基本原则 无细胞壁：温和去污剂（溶解细胞膜，释放大部分细胞内蛋白；保持蛋白结构或酶活力）有细胞壁：机械剪切或酶消化法去除细胞壁 抑制蛋白酶活性：低温操作，加入蛋白酶抑制剂（PMSF，aporotinin）,裂解缓冲液的选择 a:NP-40裂解体系 组成： （150mmol/L NaCL；1.0%NP-40 ；50mmol/L Tris） 作用温和，可释放
15、大部分可溶性胞浆蛋白和核蛋白b:RIPA体系 组成： （ 150mmol/L NaCL；1.0%NP-40 ；0.5%脱氧胆酸钠；0.1%SDS；50mmol/L Tris） 变性作用更强，使胞内大部分蛋白释放，但可能破坏蛋白间作用,2.组织培养细胞的裂解： 最有效：去污剂裂解 裂解缓冲液选择：基本同裂解细胞,3.超声裂解细菌 裂解缓冲液选择：多用RIPA缓冲液 超声器选择：,4.酵母的裂解：玻璃微珠法 将玻璃微珠和酵母细胞一起涡旋振荡进行机械破碎 问题：变性（解决方法酶破坏酵母细胞壁）5.变性裂解 强去污剂沸水浴超声破碎 问题：蛋白变性（解决方法：稀释变性剂，透析）,常用的蛋白分离纯化技术,
16、3. 亲和层析,4. HPLC分离,5.电泳,6.其他层析技术：扩张柱床吸附层析技术径向膜层析技术灌注层析技术液液萃取技术置换层析技术金属螯合亲和层析技术根据抗体与抗原的亲和作用，将抗原与目的蛋白组成的融合蛋白表达，再利用结合抗体的亲和柱分离目标蛋白也取得同样好的效果。,重组蛋白纯化的基本策略,一、融合表达蛋白的纯化： 融合表达蛋白可以在原目标分子之外带有GST肽段或（His）6肽段，从而使得可以分别用Glutathione Sepharose凝胶或Chelating Sepharose凝胶进行亲和色谱分子，一步可以达到90%的纯度，经过特异蛋白酶切后，再进行离子交换及高分辨凝胶过滤一般便可以达到所需的纯度（9599%）。 二、包含体表达蛋白的纯化： 在E.coli系统表达重组蛋白，表达量高时，常形成包含体，包含体易于与细胞其他组分分离，但需要注意的是蛋白复性的步骤。一般采用盐酸胍溶解包含体蛋白后，用稀释的办法进行复性，也可以利用凝胶过滤色谱进行复性（已有多种凝胶可以促进蛋白质的复性的报道）。,
