经典免疫学试验,沉淀反应

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1、,免疫学检验,第十三章 沉淀反应,可溶性抗原+相应抗体肉眼可见的沉淀,返回总目录,目 录,1897年 Kraus 就发现细菌培养液（毒素）与相应抗血清混合出现沉淀1905年 Bechhold 把抗体放在明胶中，将抗原加于其中，发现沉淀反应可在凝胶中进行1946年 Oudin 报告了试管免疫扩散技术1965年 Mancini 提出单向免疫扩散技术，使定性免疫试验向定量化发展免疫浊度法的出现，使沉淀反应达到快速、微量、自动化的新阶段。,根据沉淀反应的介质和检测方法的不同, 沉淀反应可分为:液相内的沉淀反应凝胶内的沉淀反应,第一节 液体内沉淀试验根据沉淀现象的不同，液体内沉淀又可分为三类：絮状沉淀环

2、状沉淀免疫浊度沉淀,一、絮状沉淀试验絮状沉淀试验是一项经典实验技术。曾用于测定梅毒抗体的Kahn试验是絮状沉淀的代表试验，现今已被更简便而敏感的USR或RPR方法替代。,(一) 原理抗原溶液与相应抗体溶液混合，在电解质存在的条件下，抗原与抗体结合出现可见的絮状沉淀。絮状沉淀易受抗原与抗体比例的影响，由此可作为最适比测定的基本方法。,(二) 操作步骤 1. 抗原稀释法 (1) 将可溶性抗原作一系列倍比稀释。 (2) 各管加入一定浓度的适量抗血清。 (3) 振摇使抗原、抗体充分混匀，置37孵育。 (4) 产生沉淀量随抗原量而不同，以出现沉淀物最多的管为最适比例管。,2. 抗体稀释法 本法采用抗原量

3、恒定与不同倍比稀释度的抗体反应，出现沉淀物最多的管为抗体最适比例管。 3. 方阵滴定法 抗原和抗体同时稀释，亦称棋盘(checkerboard)滴定法，是前二法的结合，可一次完成抗原和抗体的滴定并找出抗原、抗体的最适比。,(三) 方法评价 絮状沉淀试验方法简单，设备要求低，敏感度较低，受抗原抗体比例影响非常明显，目前多用以测定抗原抗体反应的最适比。,二、环状沉淀试验环状沉淀(ring precipitation)试验是由Ascoli于1902年建立的一种经典的血清学定性试验。用非常简便的技术了解待测血清内是否存在某种抗原或抗体。,(一) 原理 把抗原溶液小心地加于已含抗体溶液的细试管液面上。当

4、对应的抗原与抗体相遇，在界面处形成清晰的乳白色沉淀环。,(二) 操作步骤 1. 用毛细滴管吸取抗血清加于沉淀管(内径 约1.52mm)底部，避免产生气泡。 2. 将抗原溶液沿管壁缓缓叠加于抗血清液面上，形成清晰的交界面。 3. 置沉淀管于室温下使其反应，15min内在两界面间呈现乳白色沉淀环为阳性。30min仍无沉淀环出现则为阴性。,(三) 方法评价该试验是经典的血清学反应之一，简便、快速、实用。故用于鉴定血迹和诊断炭疽(Ascoli试验)。只能定性，不能定量、敏感性较低(320mg/L)，对含有多个抗原抗体对的反应系统缺乏分辨力。方法难以推广。,三、免疫浊度试验经典的免疫沉淀试验是抗原和相应

5、抗体在反应终点时判定结果，方法存在耗时、敏感度低(10100mg/L)和不能自动化等缺点。70年代以来，根据抗原和抗体所在液相内快速结合并产生浊度的原理，建立了免疫比浊法。临床常用3种微量免疫技术，即透射比浊法、散射比浊法和免疫胶乳比浊法，借助多种自动化分析仪器来完成。,(一) 透射比浊法 1. 原理 抗原抗体在一定缓冲液中形成免疫复合物(IC)，当光线透过反应溶液时，由于溶液内复合物粒子对光线的反射和吸收，引起透射光减少，免疫复合物量越多，透射光越少，即光线吸收越多，可用吸光度表示。吸光度和复合物的量成正比，当抗体量固定时，与待检抗原量成正比。用抗原标准品建立标准曲线，可测出待检抗原含量。,

6、2. 操作步骤 (1) 用稀释缓冲液将待检样品和标准品按规定稀释，取一定量加至测定管中。 (2) 加最适工作浓度(用方阵法预先滴定)的抗体，孵育一定时间，测定吸光度(A)值。 (3) 以不同浓度抗原含量为横轴，吸光度为纵轴，绘标准曲线。从标准曲线可得待检抗原量。,3. 方法评价 敏感度高于单相琼脂扩散试验510倍，批内、批间重复性较好，变异系数10%，操作简便快速，1h可报告结果。,(二) 散射比浊法 散射光系指一定波长的光沿水平轴照射，碰到小颗粒的免疫复合物，光线被折射，发生偏转，这种偏转的角度可因光线波长和颗粒大小不同而有所区别。散射浊度法是在入射光的一定角度检测粒子发出的散射光，散射光的

7、强度与复合物的含量呈正比，即待测抗原越多，形成复合物越多，散射光强度越强。又可分为速率散射比浊法和终点散射比浊法。,1. 速率散射比浊法 (1) 原理：是一种抗原抗体结合动态测定法。所谓速率是抗原抗体结合反应过程中，在单位时间内两者结合的速度。速率法是测定最大反应速率，即在抗原抗体反应达最高峰时，通常为数十秒钟，测定其复合物形成的量。峰值的高低在抗体过量情况下与抗原的量成正比。峰值出现的时间与抗体的浓度及其亲和力直接相关。不同抗原含量其速率峰值不同，通过微电脑处理，求出抗原含量。,(2) 操作步骤： 1) 用稀释液将待检抗原稀释成一定浓度。 2) 将稀释待检抗原和不同浓度抗原标准品加至试管内，

8、再加入一定量抗体，立即比浊，记录速率单位(RU)。 3) 以抗原标准品含量为横坐标，RU值为纵坐标，于普通坐标纸上绘制标准曲线。根据待测抗原RU值，查出相应抗原含量。,(3) 方法评价： 检测不必等到抗原抗体反应达到平衡，大大节约反应时间，每小时可检测数十份标本，敏感度高，最小检出量达g/L水平。,2. 终点散射比浊法 (1) 原理：让抗原抗体作用一定时间，使其反应达到平衡后，测定其复合物的量。复合物的浊度不再受时间的影响，但反应复合物聚合产生絮状沉淀之前(大约反应数十分钟)进行浊度测定。,(2) 操作步骤 1) 用稀释液稀释待检抗原和抗原标准品。 2) 取一定量稀释待检抗原液和不同浓度抗原标

9、准品溶液加至试管中，加抗体充分混匀，孵育一定时间，比浊。 3) 以抗原标准品量为横坐标，浊度值为纵坐标，绘制标准曲线。根据待检抗原的浊度值，查出抗原含量。,(3) 方法评价： 敏感度达mg/L水平，可自动化，但反应时间较长,(三) 免疫胶乳比浊法 1. 原理 选择一种大小适中，均匀一致的胶乳颗粒，吸附抗体后，当遇到相应抗原时，则发生凝集，单个胶乳颗粒在入射光波长之内，光线可透过，当两个胶乳凝集时，则使透过光减少。这种减少的程度与胶乳凝集成正比，与抗原量成正比。,2. 操作步骤 1) 用稀释液将待测抗原和抗原标准品稀释。 2) 将抗体致敏胶乳溶液和待测抗原、不同浓度的抗原标准品反应一段时间，测吸

10、光度值。 3) 以抗原标准品量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，查出待测抗原量。,3. 方法评价 敏感度高，试剂稳定，因反应液中无PEG沉淀剂的影响，个体IC对结果影响也小，所以结果稳定、可靠，特异性好；不需特殊仪器设备，一般分光光度计、自动化生化分析仪或散射比浊仪均可使用。,第二节 凝胶内沉淀试验凝胶内沉淀试验(gel phase precipitation)主要是指琼脂糖扩散或称凝胶扩散(gel diffusion)。常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝胶等。根据实验目的与方法不同，可将固相内沉淀验分为3类：双相琼脂扩散试验(double gel diffusion tes

11、t)，单相琼脂扩散试验(single gel diffusion test)，凝胶免疫电泳(gel immuno-electrophoresis)。这是一项凝胶内电泳加扩散技术，专门一章介绍。,一、单相琼脂扩散试验 (一) 原理 将一定量的抗体混入琼脂凝胶中，使待测的抗原物质在凝胶中自由扩散，与抗体结合形成沉淀环，沉淀环的大小与抗原浓度呈正相关。,(二) 操作步骤 1. 将抗体和0.9%琼脂糖5056混合，即刻倾注成平板。 2. 待凝固后在琼脂板上打孔，孔中加入已稀释的抗原溶液和不同浓度的抗原标准品溶液。 3. 置37，让其向四周自由扩散，2448h后可见其孔周围出现沉淀环。,(三) 方法评价

12、 单向琼脂扩散试验是一种稳定、简便、毋需特殊设备，一般实验室均可使用的常规方法，试验的重复性和线性均好。敏感度为1.25mg/L。,(四) 影响因素 1. 抗原分子量 抗原分子量大，扩散慢，沉淀环较小；抗原分子量小，扩散快，沉淀环相对较大。要求待检血清和抗原标准品在血清学上具有均一性，否则可能出现结果偏高或偏低。,2. 抗体种类 实验证明兔抗血清优于马、羊抗血清，兔抗血清可测抗原0.11IU/ml，马抗血清为110IU/ml，羊为0.44IU/ml，为提高实验敏感度，应首选敏感度高的抗血清。,3. 抗体稀释度 抗体浓度大，沉淀环小，则敏感度低；抗体浓度小，沉淀环增大，不同浓度抗原间的差别较显著

13、，敏感度高。但沉淀环过大，常造成边缘糊不清，致使测量误差也增大。因此要求在沉淀环清晰的基础上加大稀释度以提高敏感度。下图为抗体分别以1:25、1:50、1:75、1:100稀释，所形成的4条标准曲线。,4. 扩散时间 抗原达到扩散终点后，其沉淀环直径才与抗原含量呈一定关系。抗原含量越高，达到一定关系所用扩散时间越长 5. 扩散温度 在437范围内，提高温度加快扩散速度，缩短反应时间。但有的沉淀环仅在低温下形成，温度高反而消失。在同一次试验的孵育过程中，要防止温度急剧变化，以免出现双圈。 6. 琼脂板厚度 琼脂板厚度增加，沉淀环面积相应缩小。,二、双相琼脂扩散试验 (一) 原理 将可溶性抗原和抗

14、体置于琼脂凝胶板的对应孔中，两者各自在凝胶中向四周自由扩散，当抗原与抗体相遇，在比例合适时形成可见的白色沉淀线。沉淀线的特征与抗原抗体的浓度、纯度和扩散速率等有关。,(二) 操作步骤 1. 融化琼脂，浇板 每张载玻片约4ml。 2.凝固，打孔 孔径3mm，孔间距35mm，孔型有双孔型、三角孔型、双排孔型和梅花孔型。 3. 加样 在相对孔内加抗原或抗体。 4.孵育 使抗原抗体自由扩散，在两孔之间抗原抗体相遇，在比例适时形成可见的沉淀线。沉淀线的数目、形态和位置与抗原和抗体的纯度、浓度和扩散速度有关。,(三) 双相琼脂扩散试验的应用 1. 检测未知抗原或抗体 将已知的抗体或抗原与待检标本加入成对孔

15、中，根据沉淀线有无定性；根据沉淀线的位置估计抗原或抗体的相对含量；根据沉淀弧形状判断抗原或抗体的相对扩散速率，见图 。,A：Ag、Ab浓度及扩散率近似；B ： Ag、Ab浓度近似，扩散率Ag Ab ； C：Ag、Ab浓度近似，扩散率Ag Ab ；D： 扩散率近似，浓度Ag Ab ；E：浓度Ag Ab，扩散率Ag Ab ；F：浓度Ag Ab，扩散率Ag Ab,沉淀线形状、位置与抗原抗体扩散率及浓度的关系,2. 抗原性质分析 利用三角孔型，将待检抗原和标准抗原加入相邻两个孔中，与另一孔相对，根据沉淀线形状分析待测抗原，见图 。,(1) 沉淀线吻合：待检抗原与标准抗原完全相同。 (2) 沉淀线相切：待检抗原中含有与标准抗原相同的抗原，还含有另外的抗原与抗血清相对应。 (3) 沉淀线相交：待检抗原有与抗血清对应的抗原，但和标准抗原不同。 (4) 沉淀线部分吻合：待测抗原和标准抗原性质相同，但含量较低。,3. 抗体效价滴定 用梅花型孔，中间放抗原， 周围孔放下不同稀释度的 相应抗体，以出现沉淀线 的最高稀释倍数为该抗体 的效价。,