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1、临床分子生物学检验,姜威,Contents,临床分子生物学定义及其发展,临床分子生物学检验内容及其应用,存在的问题以及标准化,1,2,3,临床分子生物学发展方向,4,1.临床分子生物学定义及其发展,临床医学的主要任务是什么？,研究疾病的病因、诊断、治疗和预后，提高临床 治疗水平，促进人体健康,临床检验的主要任务,1.临床分子生物学定义及其发展,临床检验,临床微生物检验,临床免疫检验,临床生化检验,临床分子生物学检验,临床血液学检验,1.临床分子生物学定义及其发展,望问闻切,1.临床分子生物学定义及其发展,公元前300年，希波克拉底提倡尿液检查诊断疾病。1500年，内科医生开始使用尿液颜色比对图
2、进行直观尿液分析。1590年，has janssen发明了复式显微镜。1592年，伽利略发明了温度计。1684年，安东范列文虎克出版了第一本细菌绘图。,临床分子生物学定义及其发展,临床分子生物学检验的定义？,临床分子生物学检验（clinical molecular biology）是利用分子生物学理论与技术从基因组、转录组、蛋白质组、代谢组等水平研究疾病的发生发展机制、疾病的预测与风险评价、疾病的临床诊断与治疗，以及疾病的预防与控制.,1.临床分子生物学定义及其发展,第一代检验诊断早期细胞形态雪检验,第二代检验诊断 20世纪50年代生化检验,第三代检验诊断 20世界60年代免疫学检验,第四代检
3、验诊断 基因（分子生物学）检验诊断,以疾病表型改变为依据非特异滞后难以早期诊断,以疾病基因为探测对象特异性强、敏感可以早期诊断,临床检验的发展,第四代检验诊断,第三代检验诊断,1.临床分子生物学定义及其发展,1.临床分子生物学定义及其发展,1953年，Watson和Crick提出 DNA双螺旋模型，现代分子生 物学开始兴起，为分子检验奠 定了基础,James Watson 和 Francis Crick,1.临床分子生物学定义及其发展,1976年，美籍华裔科学家简悦 威（Yuet Wai Kan）首次利用 液相DNA分子杂交技术，进行 了地中海贫血的产前诊断,简悦威， 汉族，医学家。美国国籍。
4、国际医学界知名的遗传学和“脱氧核糖核酸”（DNA）专家。,第一阶段 核心技术：分子杂交技术 以基因突变位点(导致单基因疾病）为靶标,1.临床分子生物学定义及其发展,1985年，聚合酶链式反应 （PCR）技术的创建，使大量 获得靶DNA片段成为可能,大大 提高检测的特异性和灵敏性,穆利斯( K.B.Mullis ) PCR技术的发明者,1.临床分子生物学定义及其发展,PCR仪,琼脂糖凝胶电泳仪,1.临床分子生物学定义及其发展,荧光PCR仪,凝胶成像系统,以PCR技术为基础，产生的衍生技术：PCR-限制性酶切片段长度多态性（PCR-RFLP） 等位基因特异性PCR PCR-单链构象多态性技术（PC
5、R-SSCP） 实时定量荧光PCR(Quantitative Real-time PCR ),第二阶段 核心技术：聚合酶链式反应（PCR）技术 以基因组特异性序列（DNA,RNA）为靶标 为获得性（病原微生物）基因疾病（DNA,RNA）的诊断提供了有效的方法。,1.临床分子生物学定义及其发展,1.临床分子生物学定义及其发展,PCR电泳结果,Q-PCR结果,1.临床分子生物学定义及其发展,最早的微阵列图片,生物芯片： 一般指高密度固定在互相支持介质上的生物信息分子（如基因片段、DNA片段或多肽、蛋白质、糖分子、组织等）的微阵列杂交型芯片。,1.临床分子生物学定义及其发展,1.临床分子生物学定义及
6、其发展,基因芯片,基因芯片热图,第三阶段 核心技术：生物芯片（biochip）高通量技术 以基因组特异性核酸序列（DNA,RNA），蛋白质分子为靶标 为复杂性（多因素，多基因）疾病提供了有效的分子生物学检验方法,1.临床分子生物学定义及其发展,测序峰图,sanger,第四阶段 核心技术：DNA测序技术（蛋白质质谱技术） 以基因组特异性核酸序列，蛋白质分子，代谢物为靶标 特点：高灵敏度，高特异性，高通量，高自动化,1.临床分子生物学定义及其发展,核酸测序技术为临床疾病扥分子诊断提供最精确的判定依据，是分子生物学检验的金标准测序方法： 第一代：双脱氧末端终止法 第二代：焦磷酸测序法 第三代：单分子
7、实时测序，大大降低成本，有望实现1000USD对人类基因组进行测序,1.临床分子生物学定义及其发展,蛋白芯片技术,1.临床分子生物学定义及其发展,检测到阳性胃癌蛋白指纹,2.临床分子生物学检验内容及其应用,狭义的讲，目前分子生物学检验的靶标主要以核酸为主广义上讲，临床分子检验的生物标志物包含基因组DNA,各种RNA，蛋白质以及代谢物。,2.临床分子生物学检验内容及其应用,镰刀状红细胞贫血症的检测,一种常染色体退化遗传病引起原因：珠蛋白的基因发生了一个点突变基因的第6位密码子为GAG,编码谷氨酸,突变后为GTG,编码缬氨酸。 检测方法：该突变导致该基因丢失了一个可被MstII切开的限制性内切酶位
8、点。,2.临床分子生物学检验内容及其应用,脆性X染色体综合征,脆性X染色体综合征导致患者智障 （Martin-Bell综合征），脆性X综合症是由于在人体内X染色体的形成过程中的突变所导致。,已发现了致病基因FMR-1，它含有（CGG）n 三核甘酸重复序列，后者在正常人约为30拷贝，而在正常男性传递者和女性携带者增多到150500bp，称为小插入，相邻的Cpg 岛未被甲基化，这种前突变（premutation ）无或只有轻微症状。,现已可用RFLP连锁分析、DNA杂交分析、PCR扩增等方法检测,成年型多囊肾病,2.临床分子生物学检验内容及其应用,成年型多囊肾病是一种常染色体显性遗传病，发病率高，
9、约1000人中有1名致病基因的携带者，起病较晚，多在30岁以后，主要为肾和肝中出现多发性囊肿,由于通过家系分析，已证实APKD的致病基因与珠蛋白基因3端附近的一段小卫星DNA序列即3HVR(3 hypervariable region)紧密连锁，而后者在人群中具有高度多态性，因此可以通过RFLP连锁分析进行诊断。,2.临床分子生物学检验内容及其应用,乙型肝炎病毒的分子生物学检验,乙型肝炎病毒核酸的检验 HBV DNA是病毒复制和传染性的直接标志。定量检测HBV DNA对于判断病毒复制程度、传染性大小、抗病毒药物疗效等有重要意义。 PCR引物常根据其S、C、P 和X 基因中的高度保守序列来设计,
10、荧光定量PCR技术 能准确地反映HBV DNA的复制水平、病程变化和治疗恢复情况等，特异性高。,支链DNA技术，核酸杂交技术等。,丙型肝炎病毒的分子生物学检验,2.临床分子生物学检验内容及其应用,丙型肝炎病毒的核酸检测肝组织内HCV RNA检测可应用斑点核酸杂交技术，血清中HCV RNA检测多采用PCR、核酸杂交、bDNA、基因芯片、转录介导的扩增系统等技术。,5UTR区的序列最保守，种系变化程度及进化率很低，可用于区分主要基因型,2.临床分子生物学检验内容及其应用,埃博拉病毒的分子生物学检测,2014年埃博拉病毒感染在西非引起高致死性出血热疫情流行，目前对该病毒缺乏特异性的疫苗和治疗方案，早
11、期快速诊断能明显降低感染死亡率。,EBOV引物设计必须兼顾各亚型的敏感性，避免其他类似出血热病毒干扰，目前一般选择EBOV高度保守的GP或NP作为扩增的靶标设计引物和探针，利用逆转录PCR和实时定量荧光PCR相结合的方法来进行检测。,结核分枝杆菌的分子生物学检验,2.临床分子生物学检验内容及其应用,结核分枝杆菌可通过呼吸道、消化道或皮肤损伤侵入易感机体，引起多种组织器官的结核病，其中以通过呼吸道引起肺结核为最多。,PCR扩增所选靶序列主要有65kD抗原基因、MPB蛋白基因、rRNA基因、TB IS6110插入序列、染色体DNA的重复序列等。,PCR-RFLP ，real-time PCR，等技
12、术均可,2.临床分子生物学检验内容及其应用,2.临床分子生物学检验内容及其应用,禽流感的亚型目的基因错重PCR扩增,2.临床分子生物学检验内容及其应用,高血压的分子生物学诊断,目前关于原发高血压相关的易感基因的研究现状：1号染色体位于1p36.1的ECE1基因以及1q42-q43的AGT基因是人类血压调节的候选基因。 2号染色体2p25-p24是原发高血压的易感位点。 3号染色体位于3q21-q25的AGTR1A基因以及3p14.1-q12.3是与原发高血压相关。 4号染色体位于4p16.3的ADD1基因与盐敏感性原发性高血压相关。 7号染色体位于7q22.1的CYP3A5基因与盐敏感性原发性
13、高血压相关；位于7q36的NOS3基因与妊娠高血压相关。 11号染色体研究提示位于11q的数量性状遗传位点与血压的调节相等。,2.临床分子生物学检验内容及其应用,肿瘤的基因诊断,肿瘤基因诊断的常用方法,PCR、RT-PCR，Southern blot杂交技术、Northern blot杂交技术，基因芯片 ，基因测序等。,胃癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、肺癌等， 在p53,ER ras等基因上会有点突变。,结肠癌、肾癌、乳腺癌、脑瘤等CD44，muc-1,VLA-4等 基因的拼接会产生改变。,组织特异性基因标志物,2.临床分子生物学检验内容及其应用,存在于肿瘤及其起源的正常细胞中
14、，不存在于其他细胞。 如CEA mRNA、AFP mRNA、PSA mRNA等,血管生成因子,如血管内皮细胞生长因子（VEGF）等。,肿瘤基因诊断的常用方法,PCR、RT-PCR Southern blot杂交技术、Northern blot杂交技术 基因芯片 基因测序。,2.临床分子生物学检验内容及其应用,结核分枝杆菌的耐药性检测,耐利福平分子机制：是由于其作用靶标结核杆菌DNA依赖RNA聚合酶亚单位的编码基因（rpoB）突变所致。 当rpoB中507533位密码子的核心区域耐利福平决定区(RRDR)发生突变时，结合分歧杆菌表现为耐药,耐异烟肼分子机制：结核杆菌耐异烟肼与过氧化氢酶-过氧化物
15、酶编码基因(katG)、烯酰基还原酶编码基因(inhA)、烷基过氧化氢酶还原酶编码基因(ahpC)、2S酮酰基酰基运载蛋白合成酶编码基因(kasA)有关。 主要是katG基因的点突变、缺失、插入。,耐氨基糖苷类药物：rpsL基因发生突变 耐吡嗪酰胺：pncA 基因突变,2.临床分子生物学检验内容及其应用,16SrDNA是细菌分型最常用的目标基因,细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA。5S rRNA虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分析较困难。而16S rRNA相对
16、分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高。,3.临床分子生物学的问题以及标准化,临床实验室分子诊断现已成为临床检验各学科分支中最具发展潜力的领域,其涉及病原体核酸、人类基因和各种蛋白等大分子的测定,是临床疾病诊断中不可或缺的手段,但在临床应用中,目前仍存在同一实验室不同检测批次间或不同实验室对同一标本检测间结果的差异,这已成为时常困扰临床医师、患者以及实验室技术人员的普遍性问题。,仪器设备、试剂生产厂家和临床实验室本身在临床实验室分子诊断标准化中起着非常关键的作用。,3.临床分子生物学的问题以及标准化,通常临床实验室分子诊断标准化应,主要包括以下几个方面,。,通常临床实验室分子诊断标准化应主要包括以下几个方面。,一、临床标本采集、运送和保存的标准化,对这些标本的采集、运送和保存的标准化主要是对标本采集的具体方法、所用容器、采集量、采集时所用材料和用具、运送方式和不同时间中标本保存条件等做出明确而又详尽的规定,写成标准操作程序,二、临床标本制备处理和核酸提取方法的标准化,。,在抗原和抗体的,
