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1、,蓝色妖姬的产生,三色紫罗兰,玫瑰,目的基因,受体细胞,热烈庆祝揭牌仪式 圆 满 成 功,专题1 基因工程1.1DNA重组技术的基本工具,基因工程概念,基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术或基因拼接技术。,问题探讨：,苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。 想一想需要做哪些关键工作？,普通棉花 抗虫棉,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,
2、在以上过程中关键步骤或难点是什么？,普通棉花(无抗虫特性),苏云金芽孢杆菌,提取,抗虫基因,通过运载体导入,转基因棉花含抗虫基因,转基因棉花有抗虫特性,基因工程培育抗虫棉的主要步骤：,步骤一：,抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来,步骤二：,抗虫基因与运载体DNA“缝合”,步骤三：,抗虫基因进入棉花细胞,解决培育抗虫棉的步骤需要哪些工具？,“分子手术刀” 限制性核酸内切酶,“分子缝合针” DNA连接酶,“分子运输车”基因进入受体细胞的载体,一、DNA重组技术的基本工具,一、限制性核酸内切酶“分子手术刀”,主要来源： 种类与命名： 作用特点： 作用结果：,阅读P4-5页，限制性核酸内切酶“分子
3、手术刀”,一、限制性核酸内切酶“分子手术刀”,1.主要来源： 种类与命名： 作用特点：4.限制酶识别序列5.作用结果：,识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。,主要从原核生物中分离纯化,产生黏性末端或平末端,大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成 少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成,种类与命名：,现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内切酶(限制酶)。,EcoR,Sma,粘质沙雷氏杆菌 （Serratia marcesens）,大肠杆菌 （Escherichia coli R）,Go back,练习：流感嗜血杆菌的d
4、菌株( Haemophilus influenzae d )中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:,Hind、Hind和Hind,T,磷酸二酯键,A,（一）限制性核酸内切酶 分子手术刀,磷酸二酯键： 即脱氧核糖、磷酸之间的连接,（一）限制性核酸内切酶 分子手术刀,EcoRI限制酶的切割,黏性末端,黏性末端,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,SmaI限制酶的切割,平末端 平末端,当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。,限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可
5、以找到一条中心轴线（如图），中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向、对称、重复排列的。,想一想限制酶所识别的序列有什么特点？,要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？,要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。,如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？,会产生相同的黏性(平)末端，然后让两者的黏性(平)末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。,GAATTC CTTAAG,GAATTC CTTAAG,EcoR,将不同种来源的DNA片段连接起来,生物A基因片段,生物B基因片段,G AATTC CTTAA G,G AATTC CTTAA G,
6、酶切,限制性内切酶与DNA解旋酶的区别,切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键,将DNA两条链的氢键打开形成两条单链,限制性内切酶与DNA水解酶的区别,切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键，形成片段的DNA.,切割磷酸二酯键，形成单个的脱氧核苷酸。,二、“分子缝合针” DNA连接酶,作用:,把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将DNA片段单链中脱氧核糖和磷酸连接起来.,作用原理：,催化磷酸二酯键形成,要实现目的基因与载体的连接，则在对其切割时应选用 限制酶。,同一种,可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，,Ecoli DNA连接酶 或T4DNA连接酶,即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,T
7、4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合” 起来，但效率较低,T4DNA连接酶,类型：,EcoliDNA连接酶,T4DNA连接酶,来源,功能,大肠杆菌,T4噬菌体,恢复 磷酸 二酯键,只能连接黏性末端,能连接黏性末端和平末端(效率较低),相同点,差别,寻根问底,DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?,1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键,形成磷酸二酯键,1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链,2)将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板,三、“分子运输车” 基因进入受体细胞的
8、载体,载体需要的条件：有1多个限制酶切点对受体细胞无害导入基因能在受体细胞中复制、表达有某些标记基因，便于筛选 常用运载体：细菌的质粒噬菌体衍生物或某些动植物病毒,假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录，转基因生物能有预想的效果吗？,作为分子运输车载体，如果没有切割位点将会怎样？,霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？,目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？,常用的载体：质粒,能复制并带着插入的目的基因一起复制,有切割位点,有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别,课堂练习,.以下是四种不同限制酶切割形成的DNA片段： （1）- - -CTGCA （2） - -
9、-AC （3） GC - - - （4） - - -G- - -G - - -TG CG - - - - - -CTTAA（5） G - - - （6） - - -GC （7）GT - - - （8）AATTC - - -ACGTC - - - - - -CG CA - - - G - - - 你能用连接酶将它们连接起来吗？ （ ）和（ ）能连接成： （ ）和（ ）能连接成： （ ）和（ ）能连接成： （ ）和（ ）能连接成：, , , , ,.在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需使用（ ） 同种限制酶 B. 两种限制酶 同种连接酶 D. 两种连接酶,A,课堂练习,.不属于质
10、粒被选为基因运载体的理由是A、能复制 （ ）B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因D、它是环状DNA,课堂练习,D,课堂练习,.以下说法正确的是 （ ）A、所有的限制酶只能识别同一种特定的核苷酸序列B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接D、基因控制的性状都能在后代表现出来,C,小结,限制 酶,主要存在于原核生物中 具有专一性(识别序列) 切开DNA分子的磷酸二酯键,DNA连 接酶,连接磷酸二酯键,种类,E.coliDNA连接酶 T4 DNA连接酶,运载 工 具,具备的 条件,结构简单,大小适中 能在宿主细胞中自 我复制并稳定存在 具一个多个限制酶切位点 具标记基因,质粒、 噬菌体衍生物 、动植物病毒,
