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1、致病菌的生态研究 在致病菌筛选中的应用,微生物检验用培养基历史,最初从水中大肠菌群开始（19世纪后半叶)，食品微生物（包括饮用水）检验历史有100多年。后来 逐渐研究出许多培养基。使用的抑制剂有胆盐类、染料类（如煌绿、结晶紫、品红、美兰等等)、无机盐类（如氯化钠、叠氮化钠、氯化锂、亚硒酸盐、亚硫酸盐类等)、甘氨酸等氨基酸类、醋酸钠等有机酸类等等。后来，使用抗生素越来越多，选择性逐渐提高，但使用起来不太方便。 初期由于培养基都是国外研究出的，因此我们不易看到原始资料和基础数据。而我国自己研究出的检验用培养基数量有限。,当前情况,系统研究少，没有形成真正意义上的系统的检验理论体系。造成大学里目前没
2、有合适教材讲解食品卫生微生物检验学的传统方法部分。（推荐有关书籍）当然由于目前技术水平的限制，现代检测部分也不够完善，大学教材与实际工作结合的不是很理想。 传统检验方法目前存在的问题：选择系统不够精确。如肠杆菌科某一属的精确筛选达不到。 显色培养基是目前选择性培养基发展的主要方向。达到快速检验的目的。,总之,不管使用的选择剂有怎样变化，有一点不变，那就是选择性培养基要符合目的菌生长的特殊的生态要求。这些生态要求可以归纳为不同的生态因子。推荐书目 The Microbiological Safty and Quality of Food Barbar M.Lund et al 2001 Hand
3、book of culture media for Food Microbiology J.E.L.Corry et al 2002,微生物生长有关的生态因子,温度 营养成分 水分活度 氧气及其他气体 酸碱度,渗透压 氧化还原电位 抑菌物质 其他生命体 其他,温度,按照不同细菌的生长温度范围食品中的细菌可分为嗜冷细菌、冷营细菌 、嗜中温细菌 、嗜热细菌 。 在空肠弯曲菌检验中使用42培养，可抑制其他不耐热的弯曲菌和部分弓形杆菌。 鲜肉在不同温度放置以后，普通变形杆菌、奇异变形杆菌、摩根氏菌摩根菌和碱化普罗威登氏菌均出现生长。如果放置10以下主要出现碱化普罗威登氏菌。,猪肉保存过程中菌相的变化（
4、佐藤善博 金子精一 1986） 菌落数 30培养4日 35培养2日 保存时间 0 2日 3日 5日 7日 0 2日 3日 5日 7日 假单胞菌 19 32 38 34 33 11 7 6 4 1 不动杆菌 3 2 0 0 0 2 2 0 0 0 莫拉氏菌 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 黄杆菌 3 0 0 0 0 6 1 0 0 0 弧菌 1 1 0 0 0 2 1 2 1 0 气单胞菌 0 0 0 0 0 2 17 10 7 0 肠杆菌科 2 0 1 1 2 10 10 20 28 39 微球菌 4 1 0 0 0 1 1 1 0 0 链球菌 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0
5、乳杆菌 0 0 0 3 3 0 0 0 0 0 棒杆菌 3 2 0 1 0 3 1 0 0 0 微杆菌 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 芽孢杆菌 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 酵母 4 1 0 0 0 2 0 0 0 0 合计(菌落数） 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 注：菌落数为4个猪肉保存样的平均值。 细菌鉴定时从平板中挑出任意10个菌落（4个样共40个菌落）进行纯培养后进行鉴定。,温度对菌相确定的影响,有人用5保存猪肉7日。按不同保存时间（0、2、3、5、7日分别取样）后分别以两个温度（30培养4日35培养2日）和培养以调查菌相。 30培养时
6、以菌相以假单胞菌为主， 5保存保存2日时假单胞菌占80%以上；35培养时以肠杆菌科为主， 5保存2-5日时期气单胞菌的比例上升。 因此判断菌相时，要考虑温度等培养条件的干扰因素。,营养成分,水 碳源 氮源 硫源 磷源 矿物质 生长因子,有的致病菌生长需要特殊的营养。因此要满足其特殊的营养要求。如大多数金黄色葡萄球菌为脯氨酸缺陷型。使用酸水解的蛋白胨，可能分离不到样品中存在的金黄色葡萄球菌。,受伤菌特殊营养要求,受伤菌的恢复生长，常常需要丰富的营养，但在培养饥饿状态的受伤细菌，如水中的和海水中的受伤菌时低营养反而有利。 检验用稀释液一般使用蛋白胨水，并添加触酶、镁离子、丙酮酸、铁离子等。稀释液的
7、成分有时是很关键的。0.1%的蛋白胨水对冷冻受伤的大肠杆菌活菌回复率高。 有的细菌生长需要脂肪酸。油酸以吐温80的形式加入。志贺氏菌增菌液中使用吐温80利于受伤菌的修复。小肠结肠炎耶尔森氏菌培养中添加吐温80刺激其生长。,营养成分的比例有选择性,明串珠菌。腌制朝鲜泡菜时，如果蔗糖添加过量，就容易长明串珠菌。 蛋白质含量高时容易生长变形杆菌族等蛋白分解力强的细菌。,水分活度,微生物生长需要的最低水分活度为：一般细菌0.91，一般酵母0.88，一般霉菌0.80，嗜盐菌0.75，耐渗菌0.60。大肠杆菌、沙门氏菌生长需要的最低水分活度为0.93，产气荚膜梭菌、蜡样芽孢杆菌为0.91，金黄色葡萄球菌为
8、0.86，肉毒梭菌A和B型、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特菌为0.94（肉毒梭菌E型为0.975），空肠弯曲菌、小肠耶尔森氏菌为0.98。 在婴儿米粉等粉状食品中有时能够分离到金黄色葡萄球菌。可能就是在这种低水分活度的食品中也能缓慢生长而成为优势菌。,氧气等气体,根据生长需氧，把细菌分成专性好氧菌、厌氧菌、兼性厌氧菌、 微需氧菌和耐氧菌。 个别细菌(如布鲁氏菌)生长需要提供5-10%的CO2，否则不生长。5%的 CO2促进乳杆菌属的生长。1%或更低浓度的CO2刺激需氧菌对O2的吸收利用，但大多数细菌生长被高浓度CO2 (5-50%)抑制，甚至被杀灭。高浓度CO2不抑制沙门氏菌和产气荚膜梭菌，
9、但抑制金黄色葡萄球菌。假单胞菌对二氧化碳最敏感，乳酸菌和梭菌不敏感。变形杆菌耐CO2 ，而芽孢杆菌、肠杆菌、黄杆菌、微球菌不耐CO2 。,酸碱度,嗜酸醋杆菌2.8-4.3 枯草杆菌4.5-8.5 粪产碱菌6.4-9.7 嗜热脂肪芽孢杆菌5.2-9.2 大肠杆菌4.4-9.0 肉毒梭状芽孢杆菌4.7-8.5 肺炎克雷伯氏菌4.4-9.0 生孢梭菌5.0-9.0 普通变形杆菌4.4-9.2 双歧双歧杆菌3.8-7.2 粘质沙雷氏菌4.0-9.0 碱性胨水为增菌液分离副溶血性弧菌,铜绿假单胞菌5.6-8.0 微球菌5.6-8.1 副伤寒沙门氏菌4.5-7.8 金黄色葡萄球菌4.0-9.8 伤寒沙门氏
10、菌4.0-4.5-8.0-9.6 乳酸链球菌4.3-4.8-9.2 副溶血性弧菌4.8 - 11 酿脓链球菌6.35-9.2 蜡样芽孢杆菌 4.9-9.3 屎肠球菌4.4-4.7-9.2 乳杆菌3.8-4.4-7.2,应用举例,碱性胨水为增菌液分离副溶血性弧菌。MM增菌液就是利用酸性条件筛选沙门氏菌。 小肠耶尔森氏菌通过胃时能耐胃酸是靠分解尿素来实现的。小肠耶尔森氏菌在短时间内比其他肠道杆菌更耐碱。在该菌的分离中使用碱杀死增菌液中杂菌。在样品中假单胞菌多时，碱杀菌效果明显。另外，革兰氏阴性杆菌比革兰氏阳性杆菌对碱更敏感。,渗透压,不同细菌耐不同大小的渗透压。副溶血性弧菌在10%以下氯化钠浓度中
11、可生长，2-3%浓度中生长最好。肠球菌可在2-4%氯化钠浓度中生长， 有的甚至可在大于6.5 %的氯化钠浓度中生长。金黄色葡萄球菌可在10-15%氯化钠浓度中生长，甚至在18%氯化钠浓度中生长。空肠弯曲菌则在0.5%的氯化钠浓度中生长最好。氯化钠浓度在3.5%以上时，除沙雷氏菌外大多数肠杆菌科菌一般生长不良。 不只是氯化钠，很多化学物质都产生渗透压。液体培养基都会形成渗透压。 细菌在一定渗透压的环境中，为适应这种压力，不断从环境中吸收相容性溶质，这被认为是细菌生长的动力。,相容性与不相容性,相容性溶质（compatable solute）:为达到渗透压平衡，细胞不断积累非离子的或高水活性的即时
12、在很高浓度下也不影响其代谢的物质。 所谓不相容性是指某些分子或离子在细胞内的积累会影响细胞及其组分特别是生物大分子的正常结构和功能。原因是各种中性盐对蛋白质和胶体的结构和溶解度不同，不同的阴、阳离子会引起生物大分子不同级别的构象变化。体外试验表明钠离子严重抑制大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的醛醇酶、异柠檬酸脱氢酶和磷酸己糖异构酶。,Osmolyte,Osmolyte：为达到并平衡细胞内外的渗透压而积累于细胞内的有机或无机溶质。 两个来源：外源的和自身合成的。 不同细菌具有不同的抗高渗的机制。一般是在细胞内积累合适的溶质，如钾离子、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、丙氨酸、-氨基丁酸、甜菜碱、蔗糖、
13、海藻糖、葡萄糖、甘油、1 ,4 ,5 ,6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸(Ectoine，“四氢嘧啶” )等。其中甜菜碱、脯氨酸、Ectoine和海藻糖被认为最重要。 细菌在不同渗透压下使用不同的Osmolyte。,几种重要的Osmolyte,利用渗透压筛选致病菌的应用,金黄色葡萄球菌的筛选，用甘露醇高盐琼脂、7.5%盐肉汤等。 沙门氏菌的筛选，氯化镁孔雀石绿（MM）来筛选。 这里分别用氯化钠、氯化镁和其他成分制造高渗透压，然后用蛋白胨中的成分来解高渗透压。脯氨酸、甘氨酸、谷氨酸（金葡）。甜菜碱、谷氨酸钾及其他物质（沙门氏菌）,沙门氏菌选择性增菌液的选择作用（M.A.Morinigo等1993
14、） 培养基及培养温度 TB/43 SC/36 RV/43 菌名 24h 48h 24h 48h 48h 白色念珠菌CECT1349 - - - - - 巨大芽孢杆菌CECT44 - - - - - 藤黄微球菌CECT244 - - - - - 金黄色葡萄球菌CECT232 - - - - - 弗隆迪柠檬酸杆菌CECT401 - + + + - 产气肠杆菌CECT400 - - + + - 大肠杆菌CECT102 - - - - - 肺炎克雷伯氏菌CECT143 - - + + - 奇异变形杆菌CECT170 + + + + + 绿脓杆菌CECT108 - - + + - 粘质沙雷氏菌CECT137 - - + + - 沙门氏菌UM100 - - + + + 肠炎沙门氏菌UM497 - + + + + 副伤寒沙门氏菌CECT504 - + + + + 伤寒沙门氏菌CECT409 - - - + - 鼠伤寒沙门氏菌CECT159 - + - + + 注：+最适生长 +中等生长 +低生长 -不生长 TB:四硫磺酸盐培养基 SC:亚硒酸盐胱氨酸培养基 RV:氯化镁孔雀绿培养基（以海水和淡水样品测试）,
