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1、,临床检验基础,临床检验基础是采用各种实验室检查方法和技术，对来自机体的血液、尿液、粪便以及分泌物和排泄物等标本进行一般性状观察，理学、化学、免疫学、病原学和显微镜等检查，为疾病筛查和诊断提供简便、快速的检测结果。,第一节 概述,血液生理概要,标本采集、送检、保存与处理,标本抗凝,血涂片的制备,血细胞染色方法,血细胞显微镜计数法,教学目标,掌握：血液标本采集的方法及评价，抗凝剂的选择应用，血涂片制备方法和染色原理，血细胞显微镜计数方法。熟悉：血液生理概述和标本保存。,一 血液生理概要,1.血液的组成血浆：血液加抗凝剂后分离出来的液体部分。 血清：血液离休后自然凝固分离出来的液体。,45%,血尘
2、,55%,89%,9192%,2.血液的理化性质 血量：正常人血液量7010ml/kg体重，成人45L， 占体重的6%8%。 颜色：动脉血鲜红色 HbO2静脉血暗红色 Hbred贫血病人 红色变浅CO、氰化物中毒 樱红色 红细胞悬浮稳定性 唾液酸根形成Zeta电位,黏滞性 血细胞比容 （红细胞数量）血浆粘度 （血浆蛋白浓度） 比密 血液比密与红细胞相关男1.0551.063 女1.0511.060血浆比密与血浆蛋白相关 1.0251.030 渗透压 血浆渗透压 290310mOsm/（kgH2O） PH 7.357.45 凝固性 凝血因子激活,3.血液的功能运输功能协调功能维持内环境的稳定防御
3、功能,二、血标本的采集、送检、保存与处理,（一）血标本的采集,采血,静脉采血,毛细血管采血,普通采血法,真空采血法,静 脉 采 血 法 (venipuncture for blood collection),凡需血量较多的检查0.5ml 如：ESR、Hct、凝血因子的测定等。,部位 浅表静脉均可,常用肘部静脉，不明显时可用手背、踝部， 幼儿可用颈外静脉。 体位 坐位或卧位 捆扎时间 1min,二、静脉采血法,【采血方法】准备选择静脉消毒扎压脉带穿刺、松压脉带抽血拔针止血注入试管。如以下视频所示,静脉采血法,普通采血法,1.避免溶血,器具干燥,避免气泡 2.先拔针头,再缓缓注入试管 3.与抗凝剂
4、混匀时轻轻颠倒 4.严格消毒 5.抽血时只能外抽不能内推,真空采血法（40年代，美国BD公司）,套筒式和头皮静脉式两种 优点： 血样无需容器之间的转移，减少溶血现象，保持 血液标本的完整性，使检验结果更加准确，也有 利于防止医院内血源性传染病的交叉感染和环境 保护。 缺点： 真空采血管价格较高 注意: 采血后,先拔下刺塞针端的采血试管,后拔穿刺针。,I.采血针,2008-10-21,II.持针器,2008-10-21,2008-10-21,III.真空采血管,2008-10-21,血量0.1ml的检验项目：RBC计数、WBC计数、BPC计数、Hb测定等,毛细血管采血法,Skin punctur
5、e for blood collection,采血部位 WHO推荐采取毛细血管血以左手中指或无名指指尖内侧为宜 1手指采血：优点：方便获较多血量检查结果比较恒定缺点：与静脉血仍在某些差异。 2耳垂采血：优点：痛感轻 方便 适用于反复采集缺点：血循环差受气温影响大检查结果不恒定RBC、WBC、Hb、Hct结果均比静脉血高，特别是冬季。,3、其他部位：拇指、拇趾或足底外侧缘采血 半岁以下婴幼儿皮肤完整处 严重烧伤者,采血针三棱针或专用的“采血针”为好，使用前者应高压灭菌，一人一针。,2008-10-21,注意事项 1、采血部位皮肤完整。 2、无菌技术操作：防采血部位感染，一人一针防肝炎、艾滋病。
6、3、采血针刺入皮肤应深浅适中。 4、多项检查时，采血次序为：BPC计数RBC计数、Hb测定WBC计数与分类。 5、取血用于自动化血细胞分析仪，要防止棉球纤维混入堵塞仪器。,两种采血方法的优缺点比较,毛细血管采血,静脉采血,缺点,限制了重复实验和追 加实验，标本量少， 局部炎症可得假结果 ，组织液可混入,不同抗凝剂的使用， 改变血液性质，影响 有形成分的形态,优点,价廉、快速、操作简 便，标本可直接测定,标本代表性大，无组 织液影响，适于临床 研究，可重复实验和 追加其他实验,1.血标本运输 2.血标本保存 3.检验后标本处理,（二）血液标本运输、保存与处理,三、血标本的抗凝,1、枸橼酸钠（柠檬
7、酸钠）,a. 抗凝原理：螯合钙离子,使用方法 配成 109 mmol/L的浓度和血液1：9配成 105 mmol/L的浓度和血液1：4,化学名：3-羟基-3-羧基戊二酸（三钠盐）,c. 适用范围：止血学检验、血沉、输血保养液（毒性小）,d. 不适用于：血细胞计数,2. 乙二胺四乙酸（EDTA）盐,a. 抗凝原理： 螯合钙离子,b. 使用方法： 15g/L浓度EDTA 和血液 1：10,适用范围： 对血细胞形态影响小,适合血常规检查、 Hct,不适用于：影响血小板聚集和凝血因子功能,不宜凝血因子检查和血小板功能试验。,4. 草酸钠（乙二酸的钠盐）,a. 抗凝原理：草酸钙沉淀,b. 使用方法： 草
8、酸钠 0.1mol/L 和血液1：9,c. 适用范围： 止血学检验 。,d. 不适用于：对凝血因子V保护功能差，影响PT测定；沉淀物影响自动凝血仪的使用。,物理方法抗凝脱纤维蛋白： 将血液注入有玻璃珠的器皿中，转动，纤维蛋白缠绕凝固于玻璃球，使血液不能凝固。适用于免疫学检验和红斑性狼疮细胞检查。,小结,血液是由血细胞和血浆组成的红色、粘稠、不透明、带腥味的混悬液。凡需血液量较少的检验项目，常用皮肤采血法，通常采手指血。采血时要注意采血部位要无病变，要擦去第一滴血，不能用力挤压。凡需血液量较多的检验项目，要用静脉采血法，其采血部位常用肘前静脉。如需要抗凝抗凝血标本时，则需要根据检验项目的要求，采
9、用枸橼酸钠、乙二胺四乙酸盐和肝素等抗凝剂来阻止血液凝固。,请您练习,答案:,皮肤采血法用注意什么问题?,所选择采血部位的皮肤应完好。严格消毒皮肤，防止采血部位感染。皮肤消毒后，待乙醇挥发干后再刺针。如血流不畅，切不可用力挤压勉强采血，而应重新针刺。出血不止时，可用消毒干棉球压迫至血不再流出为止，必要时应在报告单上注明，提醒临床医生注意。进行多项细胞检查要分项采血时，采血的次序为：血小板计数、红细胞计数、白细胞计数。,请您练习,请说出静脉采血的步骤？,答案:,准备,选择静脉,消毒,扎压脉带,穿刺、松压脉带,抽血,拔针止血,注入试管。,请您练习,答案:,请说出枸橼酸钠的抗凝原理、用途及其用量？,枸
10、橼酸钠能与血液中的钙离子形成可溶性的螯合物，使Ca2+失去凝血作用，从而阻止血液凝固。主要用于血沉、凝血象和血小板功能检查。凝血象检查常用0.109mol/L的水溶液，与血液之比通常为1：9。魏氏法血沉测定用浓度为0.105mol/L，与血液比例为1:4（V：V）。,请您练习,请将下列抗凝方法和适宜的项目用线连接起来。枸橼酸钠 血细胞比容测定 乙二胺四乙酸盐 红斑狼疮细胞的检验 肝素 凝血象脱纤维法 一般血液学检查,教学目标,1.叙述载玻片的清洁方法、血涂片的制备方法及合格血片的标准。 2.阐述瑞氏染色的原理、染液成分、染色方法、注意事项和染色结果的判断。 3.知道吉姆萨染色法和混合染色法。,
11、良好血涂片的标准,厚薄适宜, 头体尾分明， 细胞分布均匀,血膜边缘整齐 两侧两端留有空隙,四 血涂片的制备,血涂片染色显微镜检查用途：细胞形态检查，细胞 数量评估，网织红、异常细胞、寄生虫检验。血膜过厚：细胞重叠缩小 血膜过薄：细胞分布不匀，白细胞多集中于边缘,1.玻片清洁：a 新玻片处理：用盐酸浸泡24小时。b 用过玻片处理：用洗涤剂清洗。c 使用中玻片处理：只能持玻片边缘，保持清洁、干燥、中性、无油腻。,操 作,30-45 ,血液,推玻片,载玻片,制备过程：,角度大,角度大 速度快 血膜厚,血滴过大,血膜过厚,造成血膜厚的原因示意图,造成血膜薄的原因示意图,角度小,血滴小 血膜薄,角度小
12、速度慢 血膜薄, 25,血膜分布不均：主要由于以下原因所致:,推片边缘不齐 血膜出现线条样缺损,碱性染料：为阳离子染料，能接受质子，染细胞核的染料。如亚甲蓝、天青。,酸性染料：为阴离子染料，能释放质子。主要有荧烷-氧杂蒽染料和偶氮染料两类，能结合细胞的碱性成分并染色，如血红蛋白、嗜酸性颗粒成分等。,3. 复合染料： 同时具有阴、阳离子型的染料如瑞氏染料,（一）染料 （天然染料和人工染料） 发色基团和助色基团使生物学染色剂产生颜色和被染 组织亲合。,五 细胞常用的染色方法,（二）细胞染色原理：,1. 物理作用：毛细管现象、渗透、吸收、吸附作用等,化学作用：a. 染料的化学成分：助色基团的存在，碱
13、性染料在溶媒中为阳离子型，易与 组织和细胞内带负电荷的酸性物质结合；而酸性染料在 溶媒中为阴离子型，与带正电荷的碱性物质结合。,瑞氏染色法,（一）染色原理分两相进行，第一相是酸性伊红与细胞中的碱性物质如血红蛋白、嗜酸性颗粒结合；碱性亚甲蓝与细胞中的酸性物质如核染色质、嗜碱性颗粒、血小板结合。第二相是亚甲蓝和伊红结合在适宜条件下形成紫色的亚甲蓝-伊红复合物，结果使白细胞核染色质成紫色（疟原虫的染色质成红色），中性粒细胞的颗粒及血小板颗粒区成紫色。,b. 蛋白质的化学性质：蛋白质中的氨基酸含有不同 数量的氨基（-NH2）和羧基（-COOH），同时还有其他活性基团。在游离状态时，-NH2获得一个H+
14、变成带正电的-NH3+，而-COOH失去一个H+ 变成带负电的-COO-。分别与不同染料结合。,c. 周围环境的酸碱度：如环境pHpI（ pI 为等电点），则蛋白质带正电，结合酸性染料；反之， pH pI，则结合碱性染料。PH H增多 易与伊红结合 染色偏红PH H减少 易与美蓝结合 偏蓝,（二）试剂1. Wright染液 瑞氏染粉0.1g,甲醇60.0ml,磷酸盐缓冲液（PBS）： （PH6.46.8）磷酸二氢钾（无水）0.3g，磷酸氢二钠（无水）0.2g, 蒸馏水加到1000ml。配好后用磷酸盐溶液校正pH，塞紧瓶口备用。,1,2,3,3. 染色方法：a. 用蜡笔在血膜两头划线，平放于染色
15、架上。b. 加瑞氏染液覆盖血膜，固定1min。c. 滴加等量或稍多的缓冲液，混匀，染色5-10分钟。d. 用清水冲洗，待干后镜检。,注意事项：a. 血膜要干透后才能染色，否则染色时易脱落b. 染色时间与染液浓度、室温及细胞多少有关，一般染液淡、染色时间长些效果好。c. 染液不能过少，以防蒸发沉淀。d. 冲洗时不能先倒掉染液，应以流水冲，防染料沉着。冲洗时间也不能长。e. 染色过淡，可复染。f. 染色过深可用水冲洗或浸泡，还可用甲醇脱色,姬姆萨染色法,（一）染色原理： 基本成分仍然是伊红和亚甲蓝，改 进了染料的质量，使细胞核着色好，结构显示更清晰，而胞浆和中性颗粒染色较差。,（二）试剂 Giemsa 甲醇 纯甘油,（三）染色方法1. 甲醇固定干燥血膜3-5min2. 将血膜在染液中浸染10-30min3. 流水冲洗,待干后镜检,瑞氏吉姆萨复合染色法 优点：细胞核与细胞质均着色良好,六 血细胞显微镜计数法,原理：将待测标本经过适当稀释（或浓缩），有时还需将标本进行染色后，充入计数池，在显微镜下计数一定体积内的细胞，再换算成每升标本内的细胞数。优点：操作简便、设备简单、价廉缺点：影响因素多、费时、费力,
