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1、10.3 紫外可见分光光度计,10.3.1 紫外可见分光光度计的主要部件,紫外可见仪器光路图,用于提供足够强度和稳定的连续光谱。分光光度计中常用的光源有热辐射光源和气体放电光源两类。,可见光区：钨丝灯和卤钨灯（350nm） 紫外光区：氢灯和氘灯（150 400 nm）,1. 光源,2.单色器,色散元件主要是棱镜、光栅和滤光片。 棱镜色散原理是依据不同的波长光通过棱镜时有不同的折射率而将不同波长的光分开。,棱镜的光学特性可用色散率和分辨率来表征；,棱镜的顶角越大或折射率越大，角色散率越大，分开两条相邻谱线的能力越强。,色散率 a. 角色散率：用d/d表示，偏向角对波长的变化率；,b. 线色散率：
2、用dl /d表示，两条相邻谱线在焦面上被分开的距离对波长的变化率；c. 倒线色散率：用d/dl 表示。,分辨率：相邻两条谱线分开程度的度量：,： 两条相邻谱线的平均波长； ：两条谱线的波长差；b ： 棱镜的底边长度；n ：棱镜介质材料的折射率。,分辨率与波长有关，长波的分辨率要比短波的分辨率小，棱镜分离后的光谱属于非均排光谱。,例如：某光谱仪在30000nm附近的分辨率为50000。,表明两条谱线的波长差必须大于或等于0.6nm，才能分辨清楚。,光栅透射光栅，反射光栅；光栅光谱的产生是光射到每一条槽上后被衍射或散射后，又在一定方向干涉，形成的各级衍射光谱。它可用于紫外、可见及红外光区，而且在整
3、个波长区具有良好的、几乎均匀一致的分辨能力。,将反射光栅的线槽加工成适当形状能使有效强度集中在特定的衍射角上。图所示反射光栅是由与光栅表面成角的小斜,面构成(闪耀光栅)，角叫做闪耀角。选择适宜的闪耀角，可以使90%的有效能量集中在单独一级的衍射上。,光栅的分辨率R光栅的分辨率R 等于光谱级次（n）与光栅刻痕条数（N）的乘积：,光栅越宽、单位刻痕数越多、R 越大。,宽度50mm，N=1200条/mm，一级光谱的分辨率：R=1501200=6104,狭缝狭缝过宽，单色光不纯，造成偏离朗伯比耳定律。狭缝过窄，光通量变小，降低了灵敏度。狭缝两边的边缘应锐利且位于同一平面上。,准直镜使进入进口狭缝的发散
4、光变成为平行光线，又将色散后的平行单色光聚集于出口狭缝。,可见光区：玻璃或石英池 紫外光区：石英池盛空白、样品的吸收池，应有相同厚度和透光性。,校正吸收池：A池装空白、B池装样品，测A；反过来，B池装空白，A池装样品，测A。两次测得的A的差值应小于1%。,3.吸收池,光 电转换器光电池光电管光电倍增管光二极管阵列检测器,4. 检测器,光电池： 特点：光电池内阻小，电流难放大，用微电流计直接测，适于单色光谱带宽S较大的低档仪器；易“疲劳”。,硒光电池,硅光电池,光电管：,光电倍增管,（photomultiplier tube, PMT）,光二级管阵列检测器：构造与原理：晶体硅上紧密排列一系列光二
5、极管检测器，光透过晶体硅时，二极管输出的电信号与光强成正比。二极管数目越多，分辨率越高特点：能进行快速光谱采集,例：HP8452A型二极管阵列，在190nm820nm范围内，由316个二极管组成。每一个二极管，可在1/10秒内，每隔2nm测定一次，可同时并行测得316个数据，1/10秒就获得全光光谱。 二极管 1 2 3 316 测定（nm）190 192 194 820,5. 讯号处理与显示器,10.3.2 分光光度计的类型和光学性能,1.单光束分光光度计,几种光路类型,结构与原理：从光源到检测器只有一束光，用空白液调 T %= 100% 和测定试样液，都在同一位置，用同一束光先后进行。 特
6、点：结构简单，但对光源发光强度的稳定性要求较高。,2.双光束分光光度计,3.光多道二极管阵列检测的分光光度计,由光源发出的光，经色差聚光镜聚焦后通过 样品池，再聚焦于多色仪的入口狭缝上。透 过光经全息栅表面色散并投射到二极管阵列 检测器。,中档仪器的光学性能,1、波长范围： 195820nm,2、波长准确度： 仪器显示的波长与单色光的实际波长之间的误差0.5nm,3、波长的重现性：0.5nm,4、透光率测量范围：0150%,5、吸光度测量范围：0.1730 +2.00,6、光度准确度：透光率满量程误差0.5%,7、光度重复性：重复测定的透光率变动值0.5%,8、分辨率 单色器分辨两条靠近的谱线
7、的能力。260nm处为=0.3nm,9、杂散光 220nmNaI（1%g/ml) 所含杂散光的强度百分比5%。,短波长区校正：苯蒸气吸收光谱或苯乙醇光谱 中波长区校正：氢灯或氘灯发射谱线常用486.13nm（F线）和656.28nm（C线） 长波长区校正：镨钕玻璃的吸收光谱,10.3.3 仪器的校正,波长的校正,苯蒸气在紫外光区有很特征的吸收峰，常用苯蒸气对波长进行校正。,在吸收池内滴上一滴液体苯，盖上吸收池使苯蒸气充满吸收池，测定其吸收光谱，用所测吸收光谱来校正波长。,镨钕玻璃滤光片的吸收光谱,常用K2CrO4标准溶液来校正吸光度标度。在进行吸光度测量时所用的吸收池要配对（样品池和参比池），
8、否则要进行校正。,吸光度的校正,表：铬酸钾溶液的吸光度,使用一段时间后，磨损和污染会造成透光性能差异，必要时进行检查和校正。要求同一浓度的溶液在同一仪器上两次测量的误差应小于1%,吸收池的校正,10.4 紫外可见分光光度分析方法,定性分析定性鉴别纯度检查和杂质限量测定 定量分析单组分的定量方法多组分的定量方法,10.4.1 定性鉴别,依据：多数有机化合物具有紫外吸收光谱特征。,1.特征值：,2. 吸收光谱形状同一化合物，在相同条件下应具有相同的吸收光谱（即吸收曲线）,定性鉴别方法：对比法,a. 对比吸收光谱特征数据是否一致,b. 对比吸光度比值或吸光系数比值,例如：维生素B12的定性鉴别,c.
9、 对比吸收光谱一致性,同样条件下，进行：试样光谱曲线与对照品光谱曲线对照，或与文献记载标准图谱对照。 紫外光谱作定性鉴别有其局限性，因光谱只有一个或几个宽吸收带，特征性不强，形状变化不大。,特别指出：在相同条件下，具有相同吸收光谱的物质，可能是同一物质。若在相同条件下，吸收光谱不同，则肯定不是同一物质。,图 三种甾体激素的紫外吸收光谱（10g/ml甲醇）,醋酸氢化可的松,醋酸泼尼松,醋酸可的松,10.4.2 纯度检查,1.杂质检查,选某，此处被检物有吸收，杂质无吸收,被检物弱吸收，杂质较强吸收,2.杂质限量检查,药物无吸收，,配杂质最高限量液C限,杂质有吸收,选测，,测定A值，作为A限，若被检
10、药物 A A限，则该药品不合格。,例：肾上腺素中微量杂质肾上腺酮含量计算,2mg/mL -0.05mol/L的HCl溶液，310nm下测定规定 A3100.05 即符合要求的杂质限量0.06%,10.4.3 单组分的定量方法,溶剂的选择,测定波长的选择,选灵敏度高，干扰少的地方测定,吸光系数法标准曲线法标准对照法,定量的方法,1. 吸光系数法（绝对法）,求百分含量：,还可以采取如下方法：,表观值,例：精密称取B12样品25.0mg，用水溶液配成100ml。精密吸取10.00ml，又置100ml容量瓶中，加水至刻度。取此溶液在1cm的吸收池中，于361nm处测定吸光度为0.507，求B12的百分
11、含量？,解：,或解：,2. 标准曲线法,芦丁含量测定,0.710mg/25mL,3. 标准对照法,注：当样品溶液与标准品溶液的稀释倍数相同时,例： 维生素B12的含量测定精密吸取B12注射液2.50mL，加水稀释至10.00mL；另配制对照液，精密称定对照品25.00mg，加水稀释至1000mL。在361nm处，用1cm吸收池，分别测定吸光度为0.508和0.518，求B12注射液的浓度以及标示量的百分含量（该B12注射液的标示量为100g / mL）,解：,对照法,10.4.4 多组分的定量方法计算分光光度法,计算分光光度法可分：,三种情况： 1两组分吸收光谱不重叠（互不干扰）两组分在各自m
12、ax下不重叠分别按单组分定量,2两组分吸收光谱部分重叠1测A1b组分不干扰可按单组分定量测Ca2测A2a组分干扰不能按单组分定量测Ca,3两组分吸收光谱完全重叠混合样品测定,（1）解线性方程组法 （2）等吸收双波长消去法 （3）系数倍率法 （4）其他方法,（1）解线性方程组法步骤：,（2）等吸收双波长消去法,步骤：,消除a的影响测b,消去b的影响测a,双波长法须满足两个基本条件：a. 选定的两个波长下干扰组分具有等吸收点b.选定的两个波长下待测物的吸光度差值应足够大；,（3）系数倍率法,前提：干扰组分b不成峰形无等吸收点,续前,步骤：b曲线上任找一点1另一点2,优点：同时将待测组分和干扰组分在
13、2处的信号放大K倍，使A值增大，灵敏度提高。但K值以57为限，否则因噪声的放大，使信噪比减小而不利于测量。,（4）导数光谱法,A=CLE=CLf（）,把一个吸收光谱写成一个波长的函数：,A函数图：,0 阶光谱图,函数图：,函数图：,函数图：,一阶导数光谱图,二阶导数光谱图,n阶导数光谱图,导数光谱图作法：,手工计算作图：每隔12nm，逐点计算,利用仪器计算机记忆与数据处理功能,导数光谱的波型和特点, 峰在 单数阶导数图是 0值偶数阶导数图 极值（利于峰值鉴定）,拐点在 单数阶导数图是 极值偶数阶导数图 0值（鉴别肩峰）, 导数阶数增加，极值数目增加极值数=导数阶数+1（分辨能力增强，鉴别重迭谱
14、带）,导数光谱的定量原理：,同理可得：,导数光谱法对干扰吸收的消除,若：干扰吸收可表达为幂函数,求一阶导数后：,则： n次函数的n阶导数为常数；n次函数在n+1阶导数图中消去。 即：干扰背景将随求导阶次的增加而逐步降幂乃至消失。,导数光谱法定量数据的测量：,导数光谱很灵敏，波长、谱带宽度、求导条件（取值、求导的阶次等）对其影响很大，不象E，能求出通用的常数，需要用标准对比法定量。,标准对比法,图 导数光谱的求导,p、峰-谷法 d、正切法 z、峰-零法,导数光谱定性和定量分析示例,定性鉴别：乙醇中痕量苯的检定一般紫外光谱法：50ppm的苯才能检出导数光谱法： 1ppm可检出,定量分析：废水中苯胺和苯酚同时定量测定,
