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1、第九章 临床常见病原体检测 Detection of clinical pathogen,1、临床各类标本的采集、运送和检查的方法；2、临床常见病原体的种类分布及变迁情况 ； 3、耐药病原体检测的意义。,医院感染常见病原体的检查。,掌握,1、药敏试验的原理和方法2、性传播疾病病原体检查的内容,了 解,熟 悉,一、临床各类标本的采集运送和检查方法 二、病原体耐药性检测 三、临床常见病原体检测 四、病毒性肝炎检测 五、性传播疾病病原体检测 六、医院感染常见病原体检测,一、临床各类标本的采集运送和检查方法,标本采集的基本原则,根据病史与临床表现确定标本采集的类型与部位，尽量采集病变明显部位标本。 在
2、发病的早期或急性期采集标本，最好在抗生素使用前（如使用过抗生素应在申请单上注明）。 采集标本防止污染，并置于无菌容器，加盖密封、立即送检。 标本必须贴上标签，与检验申请单同时送检。 所有的标本都视为感染性标本，做好安全防护。,（一）血液标本的采集,血 液,菌血症、败血症或脓毒血症,发热初期 发热前 2 小时 发热高峰期,成人：10-20婴儿、儿童：5,24小时内 采血23次,采集频率,采血量（ml）,采集时间,需厌氧同时采集可增加阳性率,（二）尿液标本的采集,采集量：10-20ml,中段尿晨尿 注意清洁 外生殖器,导尿更换新的导 尿管,穿刺尿考虑厌氧菌 感染,（三）粪便标本采集,自然排便者：挑
3、取脓、血或粘液部分于清洁容器中送检 排便困难者：采用直肠拭子采集。 怀疑霍乱弧菌感染引起的腹泻，立即接种或将标本置于碱性蛋白胨水或卡-布运送培养液送检。 传染性腹泻应连续送检3次。,（四）呼吸道标本,类型：鼻咽拭子、痰经气管采集的标本。,合格痰标本 鳞状上皮10/LP。,上呼吸道存在正常菌群， 在采集标本与结果分析 时应予考虑！,（五）脑脊液与其它无菌体液采集,胸水 腹水 心包液,无菌采集是培养成功 的首要因素!,脑膜炎奈瑟菌 肺炎链球菌 流感嗜血杆菌不耐冷！,（六）眼、耳标本采集,采样容器：运送拭子眼部标本：亦可在局部麻醉后取角膜刮屑。耳标本：外耳道疖和中耳道炎用拭子采样， 鼓膜穿刺亦可用于
4、新生儿和老年人。,（七）泌尿生殖道标本采集,女性： 外阴糜烂面病灶边缘分泌物、阴道宫颈口分泌物。 生殖道疱疹常穿刺抽取疱疹液。 盆腔脓肿患者则于直肠子宫凹陷处穿刺取脓液。,注：宫颈拭子采样时，用拭子插入宫颈3-4 cm， 轻轻转动并停留时10-15秒后取出,（七）泌尿生殖道标本采集,（七）泌尿生殖道标本采集,男性： 尿道口分泌物：性传播性疾病 前列腺液：前列腺炎 尿道拭子：在取材前2小时内不应排尿，用男性采样拭子插入尿道3-4 cm，轻轻转动并停留时10-15秒后取出,（八）创伤、组织和脓肿标本,不同部位采集多份标本,采集脓液及病灶深部分泌物,无菌干燥注射器抽取,取脓液后立即排净注射器内空气，
5、针头插入无菌橡皮塞送检。,创伤范围大,开放性脓肿,封闭性脓肿,疑为厌氧菌,（九）血清,用于检测患者特异性抗原抗体病毒肝炎性抗原抗体检测梅毒、艾滋病病毒抗原抗体检测 血清学试验,标本送检,一般要求标本采集后2小时内送达实验室。 血培养标本、脑脊液标本延迟送检不应放4保存。 烈性传染病标本需专人护送。,可能贴错条形码,这样不对，扭着我腰都酸啦！,标本的实验室质量评估标准,1、标本信息要全。2、仔细核对标本采集日期和送检日期。延误的标本，一般情况下不接收。通常用于细菌学检验的标本的存放不要超过24h。而病毒检测的标本可于4存放23天。 3、检查送检容器是否完整，有无破损或渗漏等情况，若有则不予接收。
6、 4、标本储存、运送方式不当，不予接收。,标本的实验室质量评估标准,5、明显被污染的标本不予接收。 6、标本量明显不足的标本，不予接收。 7、同一天申请做同一实验的重复送检标本(血培养除外)，不予接收 8、对于烈性传染病标本的采集和运送应严格执行相关规定，要有完善的防护措施，按规定包裹及冷藏，附有详细的采样及送检纪录，由专人护送,检查方法,（一）直接显微镜检查 （二）病原体特异性抗原检查 （三）病原体核酸检查 （四）病原体的分离培养和鉴定 （五）血清学试验,（一）直接显微镜检查-不染色标本,方法：压滴法、悬滴法、 湿片法。意义：是否有生长、活动方式。部分病原体可借此初步诊断，如梅毒螺旋体。,（
7、一）直接显微镜检查-染色标本,染色标本目的：了解细菌的形态、染色性或观察宿主细胞内包涵体。 方法：革兰染色、墨汁染色、抗酸染色、荧光染色 意义：快速诊断的方法之一,革兰染色,阳性：紫色或紫红色 阴性：红色,墨汁染色 目的：检查新型隐球菌,脑脊液标本如不能及时送检，是否可冷藏保存？为什么？,（五）脑脊液与其它无菌体液采集,胸水 腹水 心包液,无菌采集是培养成功 的首要因素!,脑膜炎奈瑟菌 肺炎链球菌 流感嗜血杆菌不耐冷！,抗酸染色,阳性：菌体呈红色 阴性：菌体呈蓝色主要用于分枝杆菌（结核）、奴卡菌鉴别,荧光染色,用形态学和免疫学相结合的方法可特异性地检测某些病原体的存在阴道加德纳菌 沙眼衣原体,
8、SARS（severe acute respiratory syndrome ） 病原体的确定。,电镜检查,电镜检查不常规用于临床，对某些病毒感染却有确诊的价值,(二)病原体特异性抗原检查,原理：利用抗原抗体之间的特异性反应，用已知 抗体检测患者血清及其他体液中的待测抗原。,方法：免疫荧光技术、酶联免疫技术、 化学发光技术、乳凝集试验、对流免疫电泳,不足：标本中如果存在多种正常寄居微生 物，可因交叉抗原存在而不能肯定诊断。,(二)病原体特异性抗原检查,细菌的血清分型： 检测细菌不同的抗原构造，还可分析细菌的菌群和血清型，如沙门菌属、志贺菌属和霍乱菌属等,（三）病原体核酸的检测,意 义 灵敏度高
9、，是检测病原体微生物最灵敏的方法，但具有一定的假阳性与假阴性。 特异性强，阳性只表明存在某种病原体的核酸，是否正被感染应结合临床具体分析。 特别适用于目前尚不能分离培养或很难分离培养的微生物。 适用于核酸变异的病原微生物，如病毒,（三）病原体核酸的检测,常用试验方法有： 1、聚合酶链式反应PCR（polymerase chain reaction）。 2、核酸探针杂交技术 3、实时荧光定量PCR （Realtime PCR） 4、基因芯片等,（三）病原体核酸的检测,（四）病原体的分离培养和鉴定,明确感染病原体 提供体外抗微生物药物敏感试验结果,1.细菌分离培养是微生物学检验中确诊的关键步骤，标
10、本的正确采集尤为重要！,（四）病原体的分离培养和鉴定,采集合适的标本,合适的培养方法/培养基、培养条件,菌落特征、生化反应结果和血清学实验进行鉴定,（四）病原体的分离培养和鉴定 鉴定的方法：手工法、仪器法（半自动、全自动、快速质谱仪）,全自动细菌鉴定仪,质谱仪,2.不能人工培养的病原体 将标本接种易感动物、鸡胚或行细胞培养,（四）病原体的分离培养和鉴定,（五）血清学试验 用已知病原体的抗原检测患者血清中相应抗体以诊断感染性疾病。,人体感染病原体后经过一定时间产生特异性抗体，在体内可维持数月或更长时间。,（五）血清学试验,方法：凝集试验、沉淀试验、补体结合试验、间接免疫荧光、放射免疫、酶联免疫吸
11、附试验。 双份血清检查：病程早期和晚期分别采血清2-3份检查，双份血清的滴度呈4倍或4倍以上升高，考虑病原体感染。 单份血清检查：特异性 IgM可作为感染性疾病的早期诊断指标，且可区分原发与复发感染。,（五）血清学试验,适用范围 血清学诊断可用于现症诊断，还可以用于疾病追溯调查。 血清学诊断对于某些病原体不能培养或难以培养的疾病，可以提供诊断的依据。不适于疾病的早期诊断，因为抗体检出最早也需在感染4-5天以后，2周后效价才逐渐增高,（六）细菌毒素检测,内毒素：革兰阴性杆菌死亡或自溶后释放。外毒素：葡萄球菌肠毒素、肉毒毒素、霍乱肠毒素。方法有生物学法、基因探针技术、免疫血清法、仪器法,二、病原菌
12、耐药性检测,概念及方法,药物敏感性试验:测定抗感染药物在体外对病原微生物有无 抑菌或杀菌作用的方法称为简称药敏试验。 方法：1、 K-B纸片琼脂扩散法2、稀释法3、浓度梯度纸条扩散法4、耐药筛选试验5、折点敏感试验,药物敏感试验,待检菌,生理盐水,MH平板,药敏试片,K-B纸片琼脂扩散法(Kirby-Bauer disc agar diffusion method）,18-24小时培养,药物敏感试验,稀释法（dilution test）琼脂稀释法 肉汤稀释法,药物敏感试验,浓度梯度纸条扩散法(gradient diffusion method),药物敏感试验,耐药筛选试验：以单一药物、单一浓度
13、检测细菌耐药性。折点敏感试验：是仅用特定抗生素检测细菌耐药性。,药物敏感试验,报告方法： 敏感(susceptible，S) S ：测试菌能被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制或杀灭。耐药(resistant，R) R：测试菌不能被在体内感染部位可能达到的抗菌药物浓度所抑制。,药物敏感试验,中度敏感(intermediate，I) I：测试菌能被测定药物大剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制或在测定药物浓集部位的体液(如尿)中被抑制。 最低抑菌浓度（Minimal inhibitory ncentration MIC) MIC ：够抑制检测菌肉眼可见生长的最低药物浓度称为最低抑菌
14、浓度。执行标准均来自临床实验室标准协会（CLSI）,（一） 概 念,耐药性（drug resistance）：是指细菌对药物所具有的相对抵抗性。 固有耐药性（intrinsic resistance）：是由细菌染色体基 因决定而代代相传的耐药，如肠道杆菌对青霉素的耐药。 获得耐药性（acquired resistance）：是细菌与药物反复接触后对药物的敏感性降低或消失，大多由质粒介导其耐药性，但亦可由染色体介导。,（二）耐药性病原体,1、耐甲氧西林葡萄球菌（MRS） 2.氨基糖苷类抗生素高耐药和耐万古的肠球菌（VRE） 3.耐青霉素肺炎链球菌（PRSP） 4、超广谱-内酰胺酶的大肠埃希菌和肺
15、炎克雷伯菌（ESBL） 5、多重耐药或泛耐药的铜绿假单胞菌和鲍曼不动相菌 6、耐拉米夫定和泛昔洛韦的乙肝病毒。,（三）耐药机制,1、细菌水平和垂直传播耐药基因的整合子系统； 2、产生抗生素灭活酶或钝化酶； 3、改变药物的作用靶位； 4、外膜通透性下降； 5、主动外排系统过度表达； 6、形成生物膜及外源耐药基因的获得。细菌的多种耐药基因可协同作用，导致多耐药菌株的出现。,（三）耐药机制,（四）耐药菌检测的意义,（四）耐药菌检测的意义,（四）耐药菌检测的意义,（四）耐药菌检测的意义,检出耐药菌需采取的重要措施： 接触隔离！,（五）病原体耐药基因检测,耐药基因的产生：1、获得外源性基因2、细菌自身基
16、因突变细菌耐药基因检测方法：PCR法、生物芯片、PCR-RFLP分析、动测序、PCR-SSCP分析,三、临床常见病原体检测,细菌、病毒、真菌、寄生虫、支原体、衣原体以及立克次体等。,（一）细菌感染检查项目的选择,细菌感染,抗原抗体检测,PCR技术 基因探针技术,培养,涂片镜检,（二）病毒感染检查项目的选择,电镜检查,核酸检测（PCR）,细胞培养,特异性抗体检测,（三）真菌感染检查项目的选择,真 菌,培养,涂片镜检,抗原检测,灾光定量PCR 核酸杂交技术 rDNA序列测序 基因组核酸电泳 核型分析,G试验GM试验,（四）寄生虫病,病原学诊断免疫学诊断寄生虫DNA探针技术PCR,（四）支原体检测,支 原 体,肺炎支原体：肺炎解脲支原体、人型支原体：泌尿生殖道感染,培养法,免疫荧光法光定量PCR和DNA探针技术,（六）螺旋体检测,暗视野显微镜检查：,梅毒血清学试验 （1）过筛试验：RPR、VDRL、TRUST （2）确诊试验：FTA-ABS、MHA-TP、 TPPA TP-PCR：TPPCR检测梅毒螺旋体DNA，特异性很强，敏感性很高，是目前诊断梅毒螺旋体的先进方法。PCR检测梅毒螺旋体的DNA，其敏感性、特异性均优于血清学方法,
