实验八乳酸脱氢酶（ LDH ）同工酶的琼脂糖凝胶电泳一、实验目的了解琼脂糖凝胶电泳的方法和原理，学会分离LDH同工酶的方法二、原理同工酶是指能够催化相同的化学反应，但酶分子的结构理化特性乃至免疫学 性质不同的一组酶， 同工酶这种差异是由于酶蛋白的编码基因不同或基因相同但 转录、翻译或后加工有别所造成的 同工酶存在于生物的同一种属或同一个体的 不同组织，甚至同一组织或细胞的不同亚细胞结构中 人们已发现几百种同工酶乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase LDH ）是人 们认识的第一个同工酶LDH 是糖酉孝解中的一个酶，它催化的反应如下COOH COOH HO—C—H+NAD＋C＝O＋NADH ＋H+CH3 CH3 LDH 有五种同工酶，分子量在13 万～15 万之间，由四个亚基组成 LDH 的 亚基有两种类型，一种是心肌型亚基（H 型） （B 基因） ，另一种是骨骼肌型亚基 （M 型） （A 基因） 两类亚基以不同比例可组成五种四聚体即LDH1(H4)、 LDH2(H3M1)、LDH3(H2M2)、LDH4(H1M3)、LDH5(M4)H 型亚基与 M 型亚基的 氨基酸组成有差异，前者含酸性氨基酸残基多，故LDH 可用电泳的方法进行分 离。
本实验用pH8.6 的缓冲液，在此条件下电泳，LDH 的五种同工酶均净带负 电荷，向正极泳动，但LDH1最快，依次减慢， LDH5最慢 在哺乳动物体内，一般厌氧性组织中，如骨骼肌、肝脏中，LDH5含量高；在 非厌氧性组织中，如心、脑中，LDH1含量高 本实验用琼脂糖凝胶， LDH 的五种同工酶在琼脂糖凝胶板上分离后，进行酶 促反应，使乳酸脱氢生成NADH ，NADH 将人工递氢体 PMS 还原，还原型 PMS 最终将 NBT 还原 NADH++H++PMS=====NAD++PMSH 2 PMSH2＋NBT======PMS ＋NBTH2 NBTH2为蓝色化合物三、实验器材（一） 、仪器 1、电泳仪 1、水平电泳槽 2、离心机 3、玻璃匀浆器 5、恒温箱 6、微量移液器 7、吸量管四、材料与试剂1、小白鼠（成年） 2、白瓷盘 3、剪子 4、镊子 5、载玻片 6、滤纸 7、生理盐水 8、0.01mol/l pH7.4 磷酸钠缓冲液：取0.01mol/L NaH2PO419ml 和 0.01mol/L Na2HPO481ml 混合即可 9、0.05mol/l pH8.6 巴比妥钠盐缓冲液：称取巴比妥钠10.3g，巴比妥 1.84g，加 蒸馏水溶解并稀释至1000m1，pH 为 8.6。
10、0.5％琼脂糖：琼脂糖0.5g，巴比妥钠盐缓冲液50ml，蒸馏水48ml， 10mol/lEDTA2ml ， 水浴加热溶解 11、染色液（以每块凝胶板用量计算） ： 取 LDH 酶活性染色液 0.5ml，0.5％琼 脂糖（预先已溶化） 0.5ml 混匀，临用前 10 分钟配制，避光保存37℃恒温箱内 12、LDH 酶活性染色液：NAD+（氧化型辅酶 I） （5mg/ml）2.5ml、NBT（氯化硝基四氮唑蓝）（1mg/ml）7.5ml、PMS（吩嗪二甲酯硫酸盐） （1mg/ml）0.5ml、 1mol/l 乳酸钠 2.5ml、0.5mol/l Tris 缓冲液（ pH7.0）3.7ml、0.1mol/lNaCl 1.3ml、 加双蒸水 25ml 13、脱色固定液： 95％乙醇 140ml、1％或 5％冰乙酸 10ml、蒸馏水 50ml五、实验步骤（一） 、LDH的提取 取成年小白鼠断头杀死，任取下列组织：心、肝、肾、脾、肺、胃、肠、舌、 骨骼肌和性腺，用生理盐水洗去血迹，称取以上组织0.1 克加20 倍体积 0.1mol/lNaPB （pH7.4） ， 用玻璃匀浆器在冰浴上匀浆， 匀浆经 3000rpm离心 20min， 取上清液用于电泳分析（在4℃冰箱保存备用）。
（二 ） 、凝胶的制备 取溶化的 0.5％琼脂糖 2.5ml，加至干净的载玻片上，凝固后即可使用 （三） 、加样 将普通滤纸剪成 12× 1.5mm 的细条，用微量移液器取 LDH 提取液 10－15μl， 将剪好的滤纸条充分浸润后，平贴在距载玻片一端的约1/3 处 （四） 、电泳 将凝胶板移入平式电泳槽内， 点样端在负极， 加入巴比妥钠盐缓冲液， 两端 用四层已浸透缓冲液的纱布“搭桥” 电压 120V，通电 40－45min （五） 、染色与固定 电泳完毕，每块凝胶板上立即加上预先配制好的染色液1.0ml，均匀覆盖， 于 37℃恒温箱内保温30－60min，至有清晰的蓝紫色带区出现 将凝胶板放入 5％乙酸中固定 30min，再用蒸馏水漂洗2－3 次，待背景无 色后，即可用于定量或扫描等处理图1 LDH 同工酶 PAGE活性染色示 意图 1、正常人血清2、猪心提取液 3、 猪骨骼肌提取液六、注意事项1、LDH 属于胞内酶，通过匀浆破碎细胞释放出LDH，像肌肉、胃、肠等较难 破碎的组织，匀浆时间可适当延长 2、铺板时应注意将载玻片放平，用吸量管吸取2.5ml 溶化的琼脂糖，一次放入 载玻片中央，让其向四周扩展，这样形成的胶面光滑平整。
3、浸润 LDH 提取液的滤纸条，要用镊子夹住贴在据载玻片一端的1/3 处，注意 与载玻片一端平行参考文献 1、张龙翔、张庭芳、李令媛，生化试验方法和技术 （第二版），高等教育出版社， 1997 2、袁玉荪、朱婉华、陈钧辉，生物化学实验，高等教育出版社，1988 3、刘粤梅、朱怀荣 ，生物化学实验教程， 1997 4、黄如彬、丁昌玉、林厚怡， 生物化学实验教程，1995 5、陈钧辉、陶力、李俊等，生物化学实验（第三版），科学出版社， 2003 。