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1、主要内容,腺相关病毒简介 腺相关病毒载体转基因技术原理 腺相关病毒载体的医学应用 优缺点总结和复习思考题,第一节 腺相关病毒简介,生物学特性 致病性与免疫性,第一部分 生物学特性,血清型 病毒结构 病毒复制 对理化因素的抵抗力,血清型,AAV是从腺病毒的污染物（1965年）、人群或非人灵长类动物等的组织中分离鉴定到的。 共鉴定了11个AAV血清型以及108个AAV变株（variants）。 通过签名PCR（signature PCR）技术，利用高度保守序列扩增Cap基因的一小段可变区的DNA序列，以筛检是否是新的AAV分离株，然后利用PCR技术获得新的AAV分离株的Cap或（和）Rep基因的全
2、长序列。在人类、非人灵长类动物、马、猪、牛、绵羊、山羊和蛇等的不同组织器官，发现了大量的具有多样性的AAV的基因组。但新分离的病毒株，尚未进行血清学分型，通称为变株。 AAV不同血清型和变株的基因组结构相对较为保守，与AAV-2型较为类似，不同血清型的衣壳蛋白结构中表位的差异。50 80% AAV-2抗体在人群中检测出。,转导不同组织器官的AAV最优血清型,不同血清型在吸附细胞表面能力、病毒受体、胞内交通和抗原性等方面具有明显的区别，以及针对不同组织和细胞的转导效率不一致，体现出不同的组织极性（tissue tropisms）,病毒结构,AAV-2 2030 nm，基因组为线性、单链的DNA分
3、子。正链和负链的单链DNA分子，以同等效率包装在病毒体衣壳中。基因组全长4679个核苷酸。 基因组包括两个ORF，三个启动子（启动子以在基因组中处的作图位置标示，分别为p5、p19和p40启动子），以及两末端为145个核苷酸的反向末端重复序列（inverted terminal repeat，ITR）,ITR,ITR中的前125个核苷酸具有回文结构，其中还存在两个小的内部回文结构，可自身折叠后经碱基配对、形成T字形的发夹结构；剩余的20个核苷酸，保持非配对状态，称为D序列（D sequence）。 ITR中还具有Rep结合元件（Rep binding elements， RBEs) RBE和
4、RBE ， 以及一个末端解离位点TRS（terminal resolution site）等重要序列。 ITR是在AAV生物学中重要的顺式（cis）作用活性元件，在病毒复制中具有重要作用：在非容许条件下，ITR在病毒复制的负调控中起关键作用；在容许条件下，作为病毒基因组复制的起点和引物。 ITR对病毒基因组的包装、转录、以及位点特异性的整合，均是必需的。,左端的ORF（Rep基因）,可编码四个Rep蛋白，即Rep78， Rep68，Rep52和Rep40，均具有螺旋酶和ATP酶活性。较大的Rep蛋白如Rep78和 Rep68，由P5启动子指导转录，分别由未剪辑和剪辑的转录物产生，具有链和位点特
5、异的核酸内切酶活性（切割点在TRS附近）以及位点特异的DNA结合活性（结合于RBE）。因此它们是重要的调节蛋白，以反式（trans）方式参与调节AAV复制周期的所有阶段，如 DNA复制、位点特异性整合、整合病毒基因组的拯救，调节病毒和细胞内基因表达的启动子等。 较小的Rep蛋白如Rep52和Rep40，由P19启动子指导转录，分别由未剪辑和剪辑的转录物产生，参与单链DNA的聚集并包装入病毒体的衣壳。,右端的ORF（Cap基因）,由P40启动子指导转录，产生两个转录物，可编码三个病毒衣壳蛋白，即VP1，VP2和VP3。 这些衣壳蛋白利用共同的ORF ，但转录起始位置不一致。 一般而言，VP1、V
6、P2和VP3的分子比是1：1：8/10。 构成这些病毒体的衣壳蛋白的比例的差异，最有可能会影响病毒的感染性，尤其是VP1含量低的情况下。缺乏VP1的病毒体没有感染性。,病毒复制,八个主要步骤： 与细胞表面受体黏附或结合 内吞（endocytosis） 在细胞内经内吞体运输 释放出内吞体 进入胞核 脱壳并释放病毒基因组 启动双链DNA的合成 整合到细胞染色体或以附加子形式持久表达病毒基因,不同血清型的AAV感染的细胞类型不同，这取决于不同血清型的AAV靶向细胞表面的受体的差异。而且这也决定了不同血清型的病毒在细胞内的不同的运输途径,AAV病毒的糖苷受体和辅助受体,AAV病毒基因组的复制模型左为R
7、Fm，右为RFd）,Rep 蛋白,AAV成功感染细胞后，依据是否有辅助病毒存在的情况下：裂解阶段（ lytic stage）和溶原性阶段（lysogenic stage）,AAV的复制周期可以分为两个阶段,溶原性阶段（lysogenic stage）:在缺乏辅助病毒如AdV、HSV等感染的情况下，AAV几乎不能复制，基因表达受到抑制，AAV基因组会整合到染色体q13.4的一个4kb大小的区域（命名为AAVS1），建立潜伏感染 裂解阶段（ lytic stage）:在辅助病毒如AdV、HSV-1等共同感染的情况下，AAV可以经历核酸复制、病毒基因表达和病毒体产生等过程，最终形成产毒性感染 受到羟
8、基脲、拓扑异构酶抑制剂或紫外线照射等处理，在缺乏辅助病毒的情况下，也可以刺激AAV的复制。AAV的复制在某些细胞也可以自发发生。,染色体q13.4的AAVS1位点中最少 33bp的序列，包含由8个核苷酸分开的RBE样和 TRS样序列，对AAV的靶向整合是必须而且充分的条件。位点特异性的整合过程即使是在Rep78和 Rep68蛋白理想表达的条件下，未必是完全是位点特异的，大约40-70%的整合发生在AAVS1位点,溶原性阶段（lysogenic stage）,AdV能提供辅助功能的基因有E1a，E1b55K，E2a，E4orf6 和 VA RNA （viral associated RNA）。H
9、SV-1能提供辅助AAV复制功能，至少涉及HSV-1的复制蛋白，包括helicase/primase complex (UL5, UL8, 和 UL52) 和DNA结合蛋白ICP8（UL29）。,裂解阶段（ lytic stage）,对环境理化因素的抵抗力,AAV对理化因素如温度和pH的抵抗力强。 对化学消毒剂如1的次氯酸钠、2戊二醛、0.25十二烷基硫酸钠等敏感。,第二部分 致病性与免疫性,约80%的人群的血清抗AAV抗体阳性，这些抗体针对的血清型是AAV-1，2，3和AAV-5型。 但针对AAV 在人群自然感染史的认识非常少，且未发现这些感染导致临床典型的病理改变或疾病。,蛋白表达型腺相关
10、病毒载体基因打靶型腺相关病毒载体 rAAV的纯化和定量,三成分包装系统 自我互补型AAV 载体（self-complementary AAV vector， scAAV） 反式剪接型AAV 载体（trans-splicing AAV vector, tsAAV） 衣壳蛋白修饰型AAV载体,第二节 腺相关病毒载体 转基因技术原理,第一部分 蛋白表达型腺相关病毒载体,三成分包装系统 :,重组AAV病毒体（rAAV，ssAAV, Sigle-stranded AAV）的组装，必须依赖于三种成分， 即：转移载体，由转基因表达读框以及两侧的野生型AAV的ITR区组成； AAV的cap和rep编码序列；辅
11、助病毒功能 建立了各种各样的方法和细胞培养系统以制备rAAV，并且这些方法和培养系统还在不断完善之中 目前最常使用的rAAV载体系统是二(或三)质粒转染HEK293法(two/three plasmid transfection of adherent HEK293 cells)，包括rAAV转移载体，rAAV辅助质粒和(或)辅助病毒质粒三部分,三成分包装系统 :,rAAV转移载体仅保留野生型AAV基因组中决定其复制、包装和整合必须的顺式作用元件基因组两端的ITR序列；全部去掉rep 和cap基因及其控制序列，用外源基因及其控制序列代替。实际包装外源基因的上限仅为4.4kb。 rAAV辅助质粒
12、是克隆的ITR缺失的野生型AAV的基因组，以反式方式提供rep 和cap基因编码蛋白的功能。目的在于病毒包装过程中，避免野生型AAV病毒的形成。 AdV辅助病毒质粒，包括其起辅助功能的基因E2a，E4orf6 和 VA RNA。 E1a和E1b55K可由HEK293细胞提供。,第一部分 蛋白表达型腺相关病毒载体,三成分包装系统优点:三成分包装系统不足:,快速、有效， 避免了辅助病毒的使用,当rAAV用于心脏、肝脏和骨骼肌等器官时，制备大量的rAAV耗时、耗力采用大规模悬浮细胞培养技术可克服这一障碍，并研制了三种替代的方法,第一部分 蛋白表达型腺相关病毒载体,三成分包装系统的大规模悬浮细胞培养技
13、术:,采用重组杆状病毒表达系统BEVS（baculovirus expression vector system），提供三种成分并感染昆虫细胞或利用包含cap和rep的稳定包装昆虫细胞系； 包含cap和rep的稳定包装哺乳动物细胞系，并通过感染AdV提供辅助功能； 利用哺乳动物细胞系和重组HSV-1提供cap和rep，rAAV和辅助功能。,第一部分 蛋白表达型腺相关病毒载体,策略2 constructed Ad helper plasmids that are cotransfected onto E1a/E1b-expressing 293 cells along with a plasmi
14、d that expresses the rep and cap genes and a vector plasmid,60C, 30 min,Forty-eight to seventy-two hours after transfection,Ad is inactivated by heat treatment,自我互补型AAV 载体（self-complementary AAV vector， scAAV）,重组AAV（ssAAV）进入细胞后，在启动蛋白表达之前，重要的限速步骤是单链基因组需要转换成为双链基因组。 McCarty等缺失了rAAV的一个ITR区的TRS（trs），阻止其突
15、变末端参与复制的启动，最终形成一个呈现串联的、单链的反向重复的基因组，其两端是野生型的ITR，但中间一个是突变型的ITR。 脱出衣壳后，将以中间突变的ITR为基础折叠形成发夹结构，形成自我互补的双链，因此，在组织或体外实验中可以快速和高效表达。 这种类型的scAAV的包装能力仅为ssAAV的一半，大约2.3kb。 最近的进展是利用scAAV表达小干扰RNA ( siRNA，small-interference RNA)。,第一部分 蛋白表达型腺相关病毒载体,自我互补型AAV 载体（self-complementary AAV vector， scAAV）,由于ssAAV和scAAV 载体的包装
16、容量均有限，限制了在基因治疗领域的应用。,第一部分 蛋白表达型腺相关病毒载体,反式剪接型AAV 载体（trans-splicing AAV vector, tsAAV）,单链线性AAV DNA 的自由末端以头-尾相接的形式经分子间内重组形成的串联的二聚体（concatemers），介导AAV在特定组织(如肌肉)中的非整合性长效表达。 利用此原理，将一个较大的外源基因拆分成两个部分，分别包括剪接供体位点SD（splice donor sites）和剪接受体位点SA（splice acceptor sites），建立两个不同的rAAV载体或不同亚型的ITR杂交载体，即反式剪接型AAV 载体； 共感染靶细胞后，可以指导两个外源基因片段形成首尾拼接的异二聚体、经正确剪接后形成完整的基因而获得表达。 该型载体可克服包装容量的限制，可达9kb，并成功在肺脏、肌肉和视网膜等表达。,第一部分 蛋白表达型腺相关病毒载体,自我互补型AAV 载体（self-complementary AAV vector， scAAV）,
