《实验一考马斯亮蓝G》由会员分享,可在线阅读,更多相关《实验一考马斯亮蓝G(2页珍藏版)》请在金锄头文库上搜索。
1、实验一考马斯亮蓝 G-250 染色法测定蛋白质的含量(p24)一、目的要求掌握考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue )法测定蛋白质含量原理和方法。二、实验原理考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度,是利用蛋白质 染料结合的原理,定量的测定微量蛋白浓度的快速、 灵敏的方法。 这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点,因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250 染料在酸性溶液中为棕红色,当它与蛋白质通过范德华键结合后,变为蓝色。在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收峰(lmax)的位置,由465nm 变为595nm。且在蛋白质一定浓度
2、范围内符合比尔定律,通过测定 595nm 处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现,染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。考马斯亮蓝染色法的突出优点是:(1)灵敏度高,据估计比Lowry 法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry 法要大的多。(2)测定快速、简便,只需加一种试剂。完成一个样品的测定,只需要5 分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2 分钟即可完成, 其颜色可以在1小时内保持稳定,且在 5 分钟至 20 分
3、钟之间,颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry 法那样费时和严格地控制时间。(3)干扰物质少。如干扰Lowry 法的 K+、Na+、Mg2+ 离子、 Tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA 等均不干扰此测定法。此法的缺点是:(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作标准曲线时通常选用g球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差。(2)仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有:去污剂、Triton X-100 、十二烷基硫酸钠( SDS)等。三、材料、试剂与器具(一) 、试剂: 1、考马斯亮蓝试剂: 考马
4、斯亮蓝 G250 100mg溶于 50ml 95%乙醇,加入 100ml 85% H3PO4,用蒸馏 水稀释至 1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含 0.01% (W/V ) 考马斯亮蓝 G250,4.7% (W/V)乙醇, 8.5%(W/V )H3PO4。 2、标准蛋白质溶液: 纯的牛血清血蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度同 0.15mol/LNaCl 配制成 100ug/ml 蛋白溶液。 (二)标准和待测蛋白质溶液1标准蛋白质溶液 纯的牛血清血蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度同 0.15mol/LNaCl 配制成 100ug/ml 蛋白溶液。2待测蛋
5、白质溶液。人血清,使用前用0.15mol/L NaCl 稀释 200 倍。(二) 、器材:1、试管 1.5 15cm( 6)和试管架。2、移液管管0.5mL ( 2); 1mL( 2); 5mL( 1);3、可见光分光光度计。 (三) 、标准曲线制作:2、以 A595nm为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标() ,在坐标轴上绘制标准曲 线。 1)利用标准曲线查出回归方程。 2)用公式计算回归方程。 一般相关系数应过0.999以上,至少 2 个 9 以上。 4) 、绘图时近两使点在一条直线上,在直线上的点应该在直线两侧。 (四) 、蛋白质含量的测定: 样品即所测蛋白质含量样品 (含量应处理在所测范围内
6、) ,依照操作步骤 1 操作, 测出样品的 A595nm,然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。 一般被测样品的A595nm值在 0.10. 5 之间,所以上述样品如果A595nm值太大, 可以稀释后再测 A595nm值,然后再计算。 (五) 、注意事项: 1、玻璃仪器要洗涤干净。 2、取量要准确。 3、玻璃仪器要干燥,避免温度变化。 4、对照:用被测物质以外的物质作空白对照。 5、在试剂加入后的520min 内测定光吸收,因为在这段时间内颜色是最稳定 的。 6、测定中,蛋白染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上,测定完后可用乙 醇将蓝色的比色杯洗干净。试管编号0 1 2 3 4 5 未知 200ug/ml 标准蛋白( ml)0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.15mol/L NaCl (ml)2 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 考马斯亮蓝试剂(ml)6 6 6 6 6 6 摇匀, 1h内以 1 号管为空白对照 ,在 595nm 处比色 蛋白质浓度( ug/ml)0 5 10 15 20 25 A595nm