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1、实验一考马斯亮蓝 G-250 染色法测定蛋白质的含量（p24）一、目的要求掌握考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue ）法测定蛋白质含量原理和方法。二、实验原理考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质 染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、 灵敏的方法。 这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250 染料在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过范德华键结合后，变为蓝色。在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰（lmax）的位置，由465nm 变为595nm。且在蛋白质一定浓度
2、范围内符合比尔定律，通过测定 595nm 处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。考马斯亮蓝染色法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry 法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry 法要大的多。（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5 分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2 分钟即可完成， 其颜色可以在1小时内保持稳定，且在 5 分钟至 20 分
3、钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry 法那样费时和严格地控制时间。（3）干扰物质少。如干扰Lowry 法的 K+、Na+、Mg2+ 离子、 Tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA 等均不干扰此测定法。此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100 、十二烷基硫酸钠（ SDS）等。三、材料、试剂与器具（一） 、试剂： 1、考马斯亮蓝试剂： 考马
4、斯亮蓝 G250 100mg溶于 50ml 95%乙醇，加入 100ml 85% H3PO4，用蒸馏 水稀释至 1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含 0.01% （W/V ） 考马斯亮蓝 G250,4.7% （W/V）乙醇， 8.5%（W/V ）H3PO4。 2、标准蛋白质溶液： 纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同 0.15mol/LNaCl 配制成 100ug/ml 蛋白溶液。 （二）标准和待测蛋白质溶液1标准蛋白质溶液 纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同 0.15mol/LNaCl 配制成 100ug/ml 蛋白溶液。2待测蛋
5、白质溶液。人血清，使用前用0.15mol/L NaCl 稀释 200 倍。（二） 、器材：1、试管 1.5 15cm（ 6）和试管架。2、移液管管0.5mL （ 2）； 1mL（ 2）； 5mL（ 1）；3、可见光分光光度计。 （三） 、标准曲线制作：2、以 A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（） ，在坐标轴上绘制标准曲 线。 1）利用标准曲线查出回归方程。 2）用公式计算回归方程。 一般相关系数应过0.999以上，至少 2 个 9 以上。 4） 、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。 （四） 、蛋白质含量的测定： 样品即所测蛋白质含量样品 （含量应处理在所测范围内
6、） ，依照操作步骤 1 操作， 测出样品的 A595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。 一般被测样品的A595nm值在 0.10. 5 之间，所以上述样品如果A595nm值太大， 可以稀释后再测 A595nm值，然后再计算。 （五） 、注意事项： 1、玻璃仪器要洗涤干净。 2、取量要准确。 3、玻璃仪器要干燥，避免温度变化。 4、对照：用被测物质以外的物质作空白对照。 5、在试剂加入后的520min 内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定 的。 6、测定中，蛋白染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙 醇将蓝色的比色杯洗干净。试管编号0 1 2 3 4 5 未知 200ug/ml 标准蛋白（ ml）0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.15mol/L NaCl （ml）2 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 考马斯亮蓝试剂（ml）6 6 6 6 6 6 摇匀， 1h内以 1 号管为空白对照 ,在 595nm 处比色 蛋白质浓度（ ug/ml）0 5 10 15 20 25 A595nm
