《山东大学研究生国家精品课程PCR原理及应用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《山东大学研究生国家精品课程PCR原理及应用（57页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、聚合酶链反应 Polymerase chain reaction（PCR）,山东大学医学院 免疫学研究所王晓燕,概 述,聚合酶链反应（PCR）是一种在体外扩增特定基因或DNA序列的方法，又称基因体外扩增法，具有特异性、高效性和高度准确性三大特点。,发展简史 常规多聚酶链反应 常用的几种PCR技术 PCR的应用,一、发展简史,1985年：美国PE-Cetus公司的Mullis首次发明了PCR技术，采用的是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow大片段 1988年初：Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR反应 1988年：Sarki 利用从水生嗜热杆菌（Thermus aquaticus)中
2、提取的耐热DNA多聚酶-TaqDNA多聚酶进行PCR研究,二、常规多聚酶链反应,（一）基本原理：PCR是体外酶促合成特异DNA片段的方法。由高温变性、低温退火及适当温度延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA片段得以迅速扩增。变性-退火-延伸-延伸,25-30循环,94-95 55左右 72,由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成： 模板DNA的变性：dsDNA ssDNA 模板DNA与引物的退火(复性)：引物与模板DNA的互补序列配对结合 引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为原料，以靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板
3、DNA 链互补的半保留复制链 新链又可成为下次循环的模板, 经2-3h可将待扩目的基因扩增放大几百万倍,5,3,5,3,变性,退火,延伸,第二循环,dsDNA,ssDNA,加入引物,5,3,3,5,dNTP, Tag酶,5,3,5,5,3,3,3,5,5,5,5,5,PCR反应的DNA扩增量呈指数上升, 最终的DNA 扩增量可用Y(1X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数。 平均扩增效率的理论值为100%，则 Y2n 。 反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止
4、期，即出现“停滞效应” 。,PCR产物计算,产物片段的长度严格地限定在两个引物链5端之间，即待扩增的特定片段。 以两条互补的DNA为模板，引物是从3端开始延伸， 其5端是固定的，这种新生链作为模板时，由于5端序列固定，就等于再次延伸片段的3端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的产物。,产物的特点,特异性强：由引物与模板DNA的特异性结合、碱基配对原则、Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性及靶基因的特异性与保守性决定 灵敏度高：皮克(pg=10-12g)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6g)水平 操作简单，省时：1-2 h 对原始材料质量要求较
5、低 有一定程度的单核苷酸错误掺入,（二）PCR的特点,（三）参与PCR反应的成分,模板：可为DNA或RNA，哺乳动物基因组DNA模板量为0.1-1g 引物：0.1-0.5 mol/L 缓冲液：10-50mmol/L Tris-HCl（PH8.3-8.8） Mg2+浓度：1.5-2 mmol/L dNTP：单核苷酸浓度50-200 mol/L TaqDNA聚合酶：100l 反应液中加入1-2.5U 的TaqDNA聚合酶,dNTP的质量与浓度,dNTP溶液呈酸性，pH7.07.5，小量分装， -20冰冻保存。 dNTP浓度：50200umol/L。 4种dNTP要等摩尔配制，如其中任何一种浓度偏高
6、或偏低，就会引起错配。 dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。,PCR引物的设计原则,上游引物与目的DNA端序列完全相同； 下游引物与目的DNA端序列互补 引物长度以15-30个碱基为宜；引物碱基尽可能随机分布，G+C含量为40-60 避免引物内形成二级结构，尤其是发夹结构 两引物间不应发生互补，特别是在端，避免形成引物二聚体,两引物间不应有同源序列，与模板DNA的其它序列也不应有同源序列 引物的3末端碱基原则上要求与模板DNA一定要配对 合成的引物应进行纯化 引物的浓度不要太高: 0.1-0.5 mol/L 引物的5末端可以进行修饰,引物的设计范例,目的DNA：ATG GGA
7、AGC TGC TGT TAC CTC CGC ACT TCG GAC-CTC CTA AGA CAC TCT CTA CAG-3 上游序列： ATG GGA AGC TGC TGT TAC CTC G+C=11/21=52% 下游序列：CTG TAG AGA GTG TCT TAG GAG-3 G+C=10/21=48%,（四）PCR反应的条件,预变性：94 3min左右 变性温度与时间：94-95 30s-1min 复性（退火）温度与时间：温度低于Tm值5 Tm=4（G+C）+2（A+C）通常温度为55-60，时间为30s-1min 延伸温度与时间：72 30s-1min 循环数：25-3
8、0 最后延伸72 5min,（五）PCR扩增产物的分析,凝胶电泳分析：初步判断产物的特异性 酶切分析：对扩增产物进行鉴定、对靶基因分型及进行变异性研究 分子杂交：检测产物特异性，分析碱基突变 核酸序列分析（测序）：是检测PCR产物特异性的最可靠方法,三、常用的几种PCR反应,（一）反转录PCR （Reverse transcription PCR，RT-PCR)反转录PCR：mRNA-cDNA-PCR 抽提RNA 反转录合成cDNA PCR 扩增,AAAAAAA-3,TTTTTTT-5,mRNA,cDNA,TTTTTTT-5,PCR,RT-PCR的基本原理,反转录酶（AMV）+ dNTP,cD
9、NA,AAAAAAA,AMV：鸟类成髓细胞白血病病毒 MMLV: 莫洛尼鼠类白血病病毒,（二）实时荧光定量PCR (Real Time Fluorescence Quantitative PCR),实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。,实时荧光定量PCR,所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的
10、方法。,1. Ct 值的定义,C代表Cycle（循环数） t代表threshold（荧光域值） Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所需要的循环次数,Ct值的确定,横坐标：PCR循环数 纵坐标：荧光信号强度 黑线：荧光域值 红线：无模板 -域值下一直线 绿线 ：样品 Ct值=17（第17个循环时，荧光信号强度达到域值）,2. 设定荧光域值（threshold）,PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准差的10倍，即：threshold = 10SDcycle 6-15,3. Ct值与起始模板的关系,研究表明，每个模
11、板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,荧光定量标准曲线,横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值. 获得未知样品的Ct值-标准曲线-该样品的起始拷贝数。,4. PCR过程的监测,监测PCR过程的方法可分为两种： 荧光探针监测 TaqMan探针 分子信标探针 Lightcycler探针 荧光染料监测 SYBR绿色荧光染料,（1）TaqMan荧光探针,TaqMan 荧光探针工作原理,用荧光基团标记PCR特异性荧光探针，探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。 探针完整时报告基团发射的荧光信号被淬灭基团
12、吸收-检测不到荧光信号； PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，报告荧光基团和淬灭荧光基团分离-荧光监测系统接收到荧光信号 每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。,TaqMan 荧光探针的缺点,采用荧光淬灭及双末端标记技术，因此淬灭难以彻底，本底较高。 采用酶外切活性，因此定量时受酶性能影响。 探针标记成本较高，不便普及应用。,（2）分子信标探针,在探针的两末端分别标记荧光基团和淬灭基团，与TaqMan探针不同的是，该探针5和3末端自身可形成8个碱基左右的发卡结构，此时荧光分子和淬灭分子邻近，因此不会产生荧光。 当溶液中有特异模
13、板时，该探针与模板杂交，从而破坏了探针的发卡结构，溶液便产生荧光，荧光的强度与溶液中探针的量成正比，因此可用于PCR定量分析。分子信标技术结合不同荧光标记可用于基因多突变位点同时分析。,（3）Lightcycler 双探针,由Roche公司开发的一种新的PCR定量技术,该技术的特点也是将荧光分子和淬灭分子分别标记在两个不同的探针上，产生荧光探针和淬灭探针，荧光探针的3端连接荧光基团；淬灭探针的5端连接淬灭基团。由于两探针设计时可与模板同一条链相邻的序列杂交，杂交时两探针的荧光基团和淬灭基团紧密相邻形成发夹结构而使荧光淬灭。荧光淬灭的程度与起始模板的量成正比，以此可以进行PCR定量分析。 该方法
14、的特点是淬灭效率高，但由于两个探针结合于模板上因此影响扩增效率，此外由于需要合成两个较长的探针，因此合成成本相对较高。,（4）SYBR荧光染料,在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料；SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。,（三）原位PCR技术 （Insitu PCR）,由Hasse等于1990年建立的，是在组织细胞里进行PCR反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点。 原位PCR技术是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术，
15、实验用的标本可以是新鲜组织、石蜡包埋组织、脱落细胞、血细胞等。,原位PCR的基本方法,固定组织或细胞:将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛处理，再灭活细胞内源性过氧化物酶。 蛋白酶K消化处理:用蛋白酶K将固定好的组织细胞片消化处理，并于96灭活蛋白酶K。 PCR扩增:在组织细胞片上，加PCR反应液，覆盖并加液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属板上，进行PCR循环扩增。 杂交:用标记的寡核苷酸探针与PCR扩增产物进行原位杂交。 显微镜观察结果,原位PCR的特点,原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置。 应用于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理转归。 特异性和敏感性高于一般的PCR。,（四）反向PCR （Reverse PCR),反向PCR(reverse PCR)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段。选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该DNA进行酶切，然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序列进行分析研究。,
