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1、第 五 章 分子生物学研究法 （上）DNA、RNA及蛋白质操作技术,基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、表达、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。,根癌土壤农杆菌（Agrobaoterium tumefaciens）侵染植物细胞后能将其Ti（tumor inducing）质粒上的一段DNA（T-DNA）插入到被侵染细胞的基因组，并能稳定地遗传给后代，植物的遗传转化（植物基因工程）技术随之得到迅
2、速发展。,5. 1 重组DNA技术史话 基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它生命科学技术的根本特征。,表5-1重组DNA技术史上的主要事件,上个世纪中下叶以来，现代分子生物学的迅猛发展源自工具酶的发现。（一）限制性核酸内切酶 能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。 第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端
3、的小片段。,图5-1 几种主要DNA内切酶所识别的序列及其酶切末端。,图5-2 DNA连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体,多聚核苷酸链中新生磷酸糖苷键的产生过程,单核苷酸5-磷酸基团向核酸链的3-OH发起进攻,RE 切割随机DNA分子（假定4种碱基在DNA中均匀分布）的概率由该酶所识别的碱基数目按照4n 来计算，如一个6碱基切割酶平均每4096 bp核DNA有一个酶切位点（46），而一个4碱基切割酶平均每256 bp核DNA就有一个酶切位点（44）。,重组DNA实验中常见的主要工具酶,嘌呤,腺嘌呤,鸟嘌呤,嘧啶,胞嘧啶,尿嘧啶,胸腺嘧啶,组成DNA和RNA分子的五种含氮碱基的结构式,仅仅
4、能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切割和重组，还不能满足基因工程的要求，只有将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上，才能在寄主细胞中进行繁殖。,具备自主复制能力的DNA分子就是分子克隆的载体（vector）。病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。,（二）基因克隆的载体 1、pSC101质粒载体 长9.09kb，带有四环素抗性基因（tetr）及EcoRI、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、PvuII以及SmaI等7种限制性核酸内切酶的单酶切位点，在HindIII、BamHI和SalI等3个位点插入外源基因，会导致tetr失活。,大肠杆菌
5、pSC101质粒载体示意图。,是第一个基因克隆载体。缺点：它是一种严紧型复制控制的低拷贝质粒，平均每个寄主细胞仅有12个拷贝，从带有该质粒的寄主细胞中提取pSC101 DNA，产量很低。,2、ColE1质粒载体 松弛型复制控制的多拷贝质粒。一般情况下，当培养基中氨基酸被耗尽，或是在细胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成，寄主染色体DNA的复制便被抑制，细胞的生长也随之停止。 松弛型质粒DNA却继续复制数小时，使每个寄主细胞中ColE1质粒的拷贝数达到10003000个，占细胞总DNA的50%左右。,ColE1质粒DNA复制起始部位调控因子之间关系,前体RNA(RNAII)的转录起始于复制起点
6、上游，需经RNaseH加工后产生有555个核苷酸的引物，起始DNA合成。RNA 1在RNA 2的5末端，转录方向相反，因此能通过氢键配对与后者相互作用，阻止RNaseH加工RNA 2，使其不能转化为有活性的引物，阻碍复制起始。没有Rop蛋白，RNA 1基因就不能起始转录。,3、pBR322质粒载体 由三个不同来源的部分组成的： 第一部分来源于pSF2124质粒易位子Tn3的氨苄青霉素抗性基因（AmpR）； 第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因（tetr）； 第三部分则来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点（ori）。,Ampr,pBR322 4.36 kb,优点是具有较小
7、的分子量（4363 bp）。能携带6-8 kb的外源DNA片段，操作较为便利。 有两种抗生素抗性基因作为转化子的选择标记。 有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增，每个细胞可累积10003000个拷贝，便于制备重组体DNA。,4、pUC质粒载体（包括四个部分）： 来自pBR322质粒的复制起点（ori） 氨苄青霉素抗性基因（ampr） 大肠杆菌-半乳糖酶基因（lacZ）启动子及编码-肽链的DNA序列。特称为lacZ基因 位于lacZ基因5-端的一段多克隆位点（MCS），外源基因插入破坏lacZ 基因功能,pUC18 2.69 kb,LacZ编码-半乳糖苷酶氨基端146个氨基酸的-肽，IPTG（异丙基-
8、 -D-硫代半乳糖苷）诱导该基因表达，所合成的-半乳糖苷酶-肽与宿主细胞编码的缺陷型-半乳糖苷酶互补，产生有活性的-半乳糖苷酶，水解培养基中的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷），生成蓝色的溴氯吲哚。含X-gal培养基中非转化菌落呈蓝色，含有重组DNA分子的菌落为白色。,优点：更小的分子量和更高的拷贝数。在pBR322基础上构建pUC质粒载体时，仅保留下其中的氨苄青霉素抗性基因及复制起点，其分子小了许多，pUC8为2750bp，pUC18为2686bp。由于缺失rop基因，pUC质粒不经氯霉素扩增时，平均每个细胞即可达500700个拷贝。,pUC质粒结构中具有来自大肠杆菌lac
9、操纵子的lacZ基因，所编码的-肽链可参与-互补作用。因此，可用X-gal显色法实现对重组体转化子的鉴定。 具有多克隆位点MCS区段，可以把具两种不同粘性末端（如EcoRI和BamHI）的外源DNA片段直接克隆到pUC8质粒载体上。,5、 pGEM-3Z质粒长度为2743bp，编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个lacZ基因。含有两个噬菌体启动子(T7和SP6)，为RNA聚合酶的附着提供了特异性识别位点。加入T7或SP6 RNA聚合酶，所克隆的外源基因便会转录出相应的mRNA。,6、穿梭质粒载体（shuttle plasmid vector）由人工构建的具有原核和真核两种不同复制起点和选择标记，
10、可在不同的寄主细胞内存活和复制的质粒载体。这类质粒载体可保证外源DNA序列在不同物种(原核和真核)的细胞内得到扩增，用途广泛。,7、pBluescript噬菌粒载体pBluescript是一类从pUC载体派生而来的噬菌粒载体，简称为pBS（+/-），如今则更多地叫作pBluescript KS（+/-）或pBluescript SK（+/-）。,SK表示多克隆位点区的取向，即lacZ基因是按照SacIKpnI的方向转录； （+/ -）表示单链噬菌体f1复制起点的两种相反的取向。 f1（+）起点表示当pBluescript噬菌粒载体和辅助噬菌体共感染寄主细胞时，能够回收到lacZ基因的有意义链D
11、NA；而f1（-）起点则表示当pBluesript噬菌粒载体与辅助噬菌体共感染寄主细胞时，可回收到lacZ基因的无意义链DNA。,(i)在多克隆位点区（MCS）的两侧，存在一对T3和T7噬菌体的启动子，用以定向指导插入在多克隆位点上的外源基因的转录； (ii)具有单链噬菌体f1的复制起点和一个来自ColE1质粒的复制起点，保证pBluescript噬菌粒载体在有无辅助噬菌体共感染时，按照不同的复制形式分别合成出单链或双链DNA；,(iii）编码有一个氨苄青霉素抗性基因，作为转化子克隆的选择标记； (iv)含有一个lacZ基因，可以按照X-gal-IPTG组织化学显色法筛选噬菌粒载体的重组子。,
12、5. 2 DNA操作技术 5. 2. 1核酸的凝胶电泳 自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。,一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，与片段大小成反比。,生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态，所以，DNA和RNA又被称为多聚阴离子（polyanions），在电场中向正电极的方向迁移。由于糖
13、-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。,琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.250kb之间。 聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到1000个碱基对之间。 凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。,表5-3 琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力 凝胶类型及浓度 分离DNA的大小范围（bp）0.3%琼脂糖 50 0001 0000.7%琼脂糖 20 0001 0001.4%琼脂糖 6 0003004.0%聚丙烯酰胺 1 00010010.0%聚丙烯酰胺 5002520.0%聚丙烯酰胺 50
14、1,溴化乙锭染料的化学结构及其对DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。,DNA脉冲电场凝胶电泳示意图,5. 2. 2 细菌转化与目标DNA分子的增殖 获得了用外源DNA片段和载体分子重组而成的杂种DNA分子后，还必须通过一个被称为细菌转化的过程将其重新导入到寄主细胞中，才能保证重组DNA分子的增殖。 外源DNA能在宿主细胞中通过自身载体上的复制起始位点进行复制增殖，从而在宿主细胞中长期保存，并以完整的形式从细胞中被分离纯化出来。,细菌转化（transformation），是指一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的D
15、NA而导致性状特征发生遗传改变的过程。,重组DNA操作过程示意图,为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处理，增加其获取DNA的能力。经过这种处理的细胞被称作感受态细胞（competent cells）。,CaCl2法 将快速生长期大肠杆菌置于经0预处理的低渗CaCl2溶液中，细胞膨胀，膜通透性改变，易与外源DNA相粘附。 将该体系转移到42下做短暂的热刺激，外源DNA就可能被细胞吸收。将经过转化后的细胞置于选择性培养基上，筛选阳性克隆。 转化效率可达到51062107个转化子/g超螺旋质粒DNA。,细菌转化及蓝白斑筛选,电击法 电脉冲可以在细胞膜上造成小凹陷，形成疏水孔洞。随着跨膜电压增加，大
16、疏水性孔洞会转变为亲水性孔洞，介质中的DNA进入细胞质。 将生长至对数中期的E. coli菌液冷却至4后离心，洗菌后用10%的甘油悬浮，将高密度菌液（21010/ml）置于特制的电极杯中进行电击。,获得最大转化效率时场强一般为12.515kV/cm，时间跨度一般为4.55.5毫秒。 电击转化与温度有关，一般在04进行。由于转化载体上常带有LacZ基因，多用带有不同抗生素的选择性培养基结合-互补蓝白斑筛选法鉴定转化细胞。,利用噬菌体颗粒能够有效地将DNA注入到寄主细胞中这一特点，科学家还发明了重组体DNA分子的体外包装法。经包装的基因工程噬菌体颗粒能够借助细菌表面的噬菌体接受器位点将DNA注入受体细菌，并在这些细胞中得到繁殖和表达。,
