分子生物学(1)

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1、1 1.分子生物学与所学专业的关系。答： （请自己归纳） 在分子水平上研究生命现象的科学。通过研究生物大分子(核酸、 蛋白质 )的结构、功能和生物合成等方面来阐明各种生命现象的本质。研究内容包括各种生命过程。比如光合作用、发育的分子机制、神经活动的机理、癌的发生等。2.分子生物 学的发展过程，3-5 个诺贝尔奖得主的贡献。分子生物学的发展历史：分子生物学的发展大致可分为三个阶段。 一、准备和酝酿阶段 19 世纪后期到20 世纪 50 年代初，是现代分子生物学诞生的准备和酝酿阶段。在这一阶段产生了两点对生命本质的认识上的重大突破：确定了蛋白质是生命的主要基础物质确定了生物遗传的物质基础是DNA

2、二、现代分子生物学的建立和发展阶段这一阶段是从50 年代初到70 年代初，以1953 年 Watson 和 Crick 提出的 DNA 双螺旋结构模型作为现代分子生物学诞生的里程碑开创了分子遗传学基本理论建立和发展的黄金时代。 DNA 双螺旋发现的最深刻意义在于：确立了核酸作为信息分子的结构基础;提出了硷基配对是核酸复制、遗传信息传递的基本方式；从而最后确定了核酸是遗传的物质基础，为认识核酸与蛋白质的关系及其在生命中的作用打下了最重要的基础。在此期间的主要进展包括：遗传信息传递中心法则的建立对蛋白质结构与功能的进一步认识三、初步认识生命本质并开始改造生命的深入发展阶段70 年代后，以基因工程技

3、术的出现作为新的里程碑，标志着人类深入认识生命本质并能动改造生命的新时期开始。其间的重大成就包括：1. 重组 DNA技术的建立和发展2. 基因组研究的发展3. 单克隆抗体及基因工程抗体的建立和发展4. 基因表达调控机理5. 细胞信号转导机理研究成为新的前沿领域诺贝尔得奖贡献1912 年英国 亨利 ?布拉格 和劳伦斯 ?布拉格 建立了 X 射线晶体学 ，成功地测定了一些相当复杂的分子以及蛋白质的结构。1915 年获得诺贝尔物理学奖1953 年 James D. Watson和 Francis H. C. Crick揭示了 DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机制。 1962得奖1958 年 Cri

4、ck 又提出了遗传信息传递的“中心法则”1959 阿瑟科恩伯格等因“发现核糖核酸和脱氧核糖核酸的生物合成机制”获得诺贝尔奖，DNA聚合酶。2 1964 年尼伦伯格与霍拉纳等终于破译了 64 个遗传密码 并于 1968 年获得诺贝尔奖1961 法国科学家莫诺与雅可布提出了 操纵子学说 并在 1965 获得诺贝尔奖1975 年 F. Sanger 、A. Maxam 和 W. Gilbert发明了 DNA快速测序技术, 1978 年沃纳。亚伯等发现限制性内切酶及其在分子遗传学中的应用。1993 年 Mullis因发明 PCR技术 （1985 年）获得了诺贝尔奖3.人类基因组计划为什么能促进分子生物

5、学进步。了解： 1986 年诺贝尔奖获得者R.Dulbecco（杜尔贝科）提出人类基因组计划测出人类全套基因组的DNA 碱基序列（3 109 bp ）基因组（ Genome）：是生物体内遗传信息的集合，是某个特定物种细胞内全部DNA分子的总和。或基因组就是一个物种 中所有 基因 的整体组成人类基因组： 3.2109 bp 人类基因组计划的科学意义：1. 确定人类基因组中约5 万个编码基因的序列及其在基因组中的物理位置，研究基因的产物及其功能。2.了解转录和剪接调控元件的结构与位置，从整个基因组结构的宏观水平上理解基因转录与转录后调节。3. 从整体上了解染色体结构，包括各种重复序列以及非转录“框

6、架序列”的大小和组织，了解各种不同序列在形成染色体结构、DNA 复制、基因转录及表达调控中的影响与作用。4. 研究空间结构对基因调节的作用。5. 发现与 DNA 复制、重组等有关的序列。6. 研究 DNA 突变、重排和染色体断裂等。7. 确定人类基因组中转座子、逆转座子和病毒残余序列，研究其周围序列的性质。8. 研究染色体和个体之间的多态性。作用：1, 治疗基因病 , 例如 : 癌症2, 改造基因 , 使人更完美 .看过吗 ?搞不定可以把你改造成基拉. 大和3, 了解生命的本质,或许可以在试管里创造生命4 中心法则，复制，转录和翻译的定义，中心法则会发生改变吗？答案： 中心法则 (geneti

7、c central dogma)，是指遗传信息从DNA 传递给 RNA ，再从 RNA 传递给蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译的过程。也可以从DNA传递给DNA ，即完成DNA 的复制过程。 这是所有有细胞结构的生物所遵循的法则。在某些病毒中的RNA 自我复制（如烟草花叶病毒等）和在某些病毒中能以RNA 为模板逆转录成DNA 的过程（某些致癌病毒）是对中心法则的补充。DNA 复制亲代 DNA 分子在DNA 聚合酶等酶的作用下，分别以每条单链DNA 分子为模板，聚合与3 自身碱基互补配对的游离dNTP， 合成出两条与亲代DNA 分子完全形相同的子代DNA 分子的过程。转录： 转录是遗传信息由D

8、NA转换到 RNA的过程。 作为蛋白质生物合成的第一步，转录是mRNA 以及非编码RNA （tRNA、rRNA等）的合成步骤。翻译：以mRNA 为模板，在核糖体上由tRNA解读，将贮存于mRNA 中的密码序列转变为氨基酸序列，合成多肽链的过程。中心法则发展方向的预测中心法则的以上形式强调了核酸对蛋白质的决定作用, 但蛋白质对核酸必然存在着反作用。 1967 年 , 梅克勒提出 , 蛋白质的空间构型( 不是线性顺序) 可以被“逆转录”成RAN顺序。1982 年, 普鲁塞纳在研究羊痒疫的致病因子时发现一种比病毒更为简单的亚病毒为其病原。令人奇怪的是, 这种病原含有侵染所必须的物质是蛋白质而不是核酸

9、。这种羊痒疫的致病因子被称谓朊病毒(virino)或蛋白侵染子(prion)。 它的发现 , 表明自然界中存在着以蛋白质为遗传信息的可能性, 即在蛋白质的指导下合成蛋白质。那么, 随着研究的进展, 也许可以将中心法则更加丰富。这作为一项对中心法则未来发展方向的预测, 只有等待科学实践来证实。中心法则的模板传递式的遗传信息流不可能包含细胞的全部信息，它也不可能是唯一的遗传信息流的通道。这并不意味着克里克当时提出的是一个错误的法则。恰恰相反， 他当时是以确定的事实，非凡的预见才建立了中心法则，并使之与近代遗传学接轨。当时有关 DNA作为遗传物质， 以及用中心法则来解释DNA控制一切性状的种种设想，

10、都是以病毒、 细菌的实验资料为根据的，所以，中心法则是完全适用于分子生物的法则。但是，当分子生物学推进到真核细胞时，由于核、质的明显区分，细胞质的进一步复杂化、独立化，中心法则的信息流已处于一个与在分子生物、原核生物中完全不同的时空框架中，原来的那种中心法则决定一切而不被一切所决定的教义已不适用，如RNA编辑已使中心法则遗传信息的模板式传递、精确的序列决定、共线性等核心观点发生动摇。可以预见， 随着分子生物学在真核细胞生物中的推进，中心法则将愈来愈失去控制一切性状的地位与意义，但是它的“三步曲”的框架仍在，人们还会叫它中心法则，它的重要性是不可抹杀的， 它的合理内涵也不容否定。随着对生命现象的

11、分子水平研究的不断深入，中心法则在生物学中终将找到它恰如其分的地位，它将作为细胞遗传信息网络中一条分子水平的通道而永存。5. PCR ， 原位杂交，southernblot， northernblot ， westernblot，免疫共沉淀原理PCR原理：变性温度下，DNA 双链变性双螺旋解开成单链DNA ，在退火温度中人工合成的特异引物根据碱基互补配对原则与单链DNA 特异结合， 然后在 DNA 聚合酶的作用下，在延伸温度下不同的脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则在引物的引导下合成与模板DNA 互补的新链，实现DNA 的扩增。原位杂交是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞 或组织切片中核酸进行

12、杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。4 其基本原理是：在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知的RNA核苷酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合（杂交），所形成的杂交体(Hybrids）经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA 、rRNA和 tRNA分子。分子杂交是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA或 RNA分子所处的位置。根据被测定的对象，分子杂交基本可分为以下几大类： Southern杂交： DNA片段经电泳分离后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤

13、膜或尼龙膜上，然后与探针杂交。被检对象为DNA ，探针为 DNA或 RNA 。 Northern杂交： RNA片段经电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上或尼龙膜，然后用探针杂交。被检对象为RNA,探针为 DNA或 RNA 。Southern 杂交原理和步骤原理： 将待检测的DNA分子用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的探针进行杂交。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。步

14、骤：Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列，它包括下列步骤 :1) 用限制性内切酶酶切DNA, 经凝胶电泳分离各酶切片段；2) 转膜：将DNA 片段转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上；3) 预杂交：封阻滤膜上非特异性位点；4) 杂交：让探针与同源DNA 片段特异性结合；5) 洗脱：去除非特异性结合的探针；6) 自显影检查目的DNA 所在的位置。 Northern 杂交基本步骤：1. 完整 mRNA 的分离2. 根据 RNA的大小通过琼脂糖凝胶电泳对RNA进行分离3. 将 RNA 转移到固相支持物上，在转移的过程中，要保持RNA 在凝胶中的相对分布4

15、. 将 RNA固定到支持物上5. 固相 RNA与探针分子杂交6. 除去非特异结合到固相支持物上的探针分子7. 对特异结合的探针分子的图像进行检测、捕获和分析Western Blot ：中文一般称为蛋白质印迹。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。 通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。原理： Western Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“ 探针 ” 是抗体，5 “ 显色 ” 用标记的二抗。 经过 PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固

16、相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。免疫共沉淀原理：免疫共沉淀 （Co-Immunoprecipitation ）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是： 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X 的抗体免疫沉淀X，那么与X 在体内结合的蛋白质 Y 也能沉淀下来。目前多用精制的protein A 预先结合固化在argarose的 beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的 prorein A 就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的