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1、大连湾牡蛎蛋白的分离提取及分子量测定崔韶晖，王艳颖，崔杰，王岩，左明，宁洪良1、试剂TrisHCI 、SDS、 2-巯基乙醇、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、TEMED 、葡聚糖凝胶G-100 (SephadexG一 100)为进口分析纯试剂；冰醋酸、NaCl、Glycine 、甘油、溴酚蓝、过硫酸铵、考马斯亮蓝、甲醇、标准蛋白(Marker) 、牛血清蛋白等为国产分析纯试剂2、仪器FSH-2 型可调高速匀浆器、TDL-40B 大容量低速离心机、旋转蒸发仪(BUCHI) 、紫外分光光度仪、垂直板电泳装置(安玛西亚 )、凝胶成像分析仪(Image Station 440CF ，KODAK) 、脱色摇床
2、、层析柱(1.0x30cm)等3、实验方法1 制备牡蛎匀浆用自来水清洗新鲜牡蛎，除去内脏，再用去离子水冲洗干净，取5 个为一组放入匀浆杯中，调速 700010000 转将牡蛎匀浆破碎成浆状组织液体2 冰醋酸粗提牡蛎中蛋白组分向匀浆液中滴加足量的冰醋酸，边滴加边用玻璃棒搅匀，直至匀浆液不再粘稠为止，静置10min，使冰醋酸与蛋白充分反应，移人离心管中离心分离，转速 4000rrain 离心 20 分钟，反复提取2 次，合并上清液，用旋转蒸发仪浓缩提取。大鼠肝细胞过氧化物酶体的提取骆子生王敏彦姜玲玲1. 1动物健康 SD 大鼠 ,体重 300 g 左右，鼠龄23 个月。由河北省实验动物中心提供。1
3、. 2试剂所用试剂均为国产分析纯试剂。1. 3主要仪器日立 80P7 超速离心机，RPS40T 水平转头，日立UV330 紫外 可见分光光度计。4、过氧化物酶体的分离大鼠断头处死后，立即取出肝脏，用冷生理盐水将血迹冲洗干净。称取 10g 肝脏，用剪子剪碎后， 加 50ml 提取缓冲液 (蔗糖 0.25mol/L ， 乙醇 0.1%， Na3EDTA 1mmol/L ，Tris-HCl ，pH7.4，10mmol/L) ，在冰浴中匀浆(以下操作均在冰浴中进行)。肝匀浆3000 r/min 、离心 10min，除去组织块，取上清液备用。向沉淀中加入50ml 提取缓冲液再次匀浆，肝匀浆3000r/m
4、in 、离心 6min，弃沉淀 (A) 。将两次离心所得上清液合并，7000 r/min 、离心 5 min，取上清。 13500 r/min 、4离心 20min,弃上清 (B)，留沉淀。向沉淀中加入40ml 缓冲液混悬后，再次13500 r/min 、离心 20 min，弃上清，取沉淀。用3ml 缓冲液将沉淀悬浮，此为过氧化物酶体的粗提物(C)。在 13ml 的 PA 离心管中加入45.8% (w /w) 的蔗糖液5ml，再缓慢加入37.4% (w /w) 的蔗糖液 4ml， 制成不连续梯度液。将混悬好的过氧化物酶体的粗提物(约 4 ml) 缓慢加在梯度液上，用 RPS40T 水平转头，慢
5、加速至27500 r/min 、离心 2 h。样品被分成肉眼可见的三层分布状态(见图 1)：上边一层是微粒体，中间一层是线粒体，最底部沉淀即是过氧化物酶体。收集管底的沉淀，用13ml 提取缓冲液悬浮，27500 r/min 、离心 2 h，洗去浓蔗糖溶液。东亚钳蝎纤溶活性蛋白的分离纯化及其作用性质研究黄锦兵1、主要实验仪器组织捣碎机：佛山市顺德区方胜电器实业有限公司KDC-40 低速离心机：科大创新股份有限公司中佳分公司JB-2 型恒温磁力搅拌器：上海雷磁新泾仪器有限公司AUY220 电子分析天平：梅特勒一上海HCTPll 5 架盘药物天平：上海精科天平KDC-160HR高速冷冻离心机：科大创
6、新股份有限公司中佳分公司DHG 一 9140A 型电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司TH-500 梯度混合器：上海沪西分析仪器厂有限公司HL-2 恒流器：上海沪西分析仪器厂有限公司BSE-100 自动部分收集器：上海沪西分析仪器厂有限公司UV-180 紫外检测仪：上海沪西分析仪器厂有限公司XWT-S 小型台式记录仪：上海自动化仪表三厂1810B 自动双重纯水蒸馏器：上海建强玻璃仪器有限公司梅特勒一托利多SevenEasy pH 计：梅特勒一托利多仪器(上海 )有限公司2、主要实验试剂：磷酸氢二钠：分析纯，天津市大茂化学试剂厂磷酸二氢钠：分析纯，天津市大茂化学试剂厂硫酸铵：分析纯，天津市福
7、晨化学试剂厂三(羟甲基 )氨基甲烷：分析纯，天津市大茂化学试剂厂盐酸：分析纯，广州市东红化工厂氢氧化钠：分析纯，天津市大茂化学试剂厂乙二胺四乙酸二钠(EDTA) ：分析纯，广州化学试剂厂氯化钡：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司聚乙二醇10000：实验试剂，天津市瑞金特化学品有限公司氯化钠：分析纯，天津市大茂化学试剂厂D45nm 透析袋：美国进口DEAE-32 纤维素：广东省汕头市西陇化工厂进口分装(沃特曼产品 ) 无水乙醇：分析纯，天津市富宇精细化工有限公司考马斯亮蓝G-250 ：USB ，北京鼎国生物技术有限责任公司磷酸：分析纯，天津市大茂化学试剂厂1 总蛋白的提取1 溶液的配制 ：pH
8、=7.6，浓度为0.02mol/L 磷酸钠缓冲液的配制取6.053g Na2HP4 12H20，0.4863g NaH2P04 2H20 定容至 1L pH=8.0，浓度为0.02mol/L Tris-HCl的配制取973.33L浓盐酸， 2.4228gTris 定容至 1L 2 实验材料准备：1透析袋的处理：新的透析袋在使用前必须要进行前处理，具体方法如下：先把把透析袋剪成适当长度(10-20cm)的小段。在大体积的2(W/V) 碳酸氢钠和lmmol/L EDTA(pH8.0)中将透析袋煮沸10 分钟。 计算 2(w/v) 的 NaHCO3溶液和 lmmol/L EDTA(pH8.0)的用量
9、：若m(NaHCO3)=2g，则V(NaHC03)=2/2=100ml ， 则需 NaHCO3溶液 l00ml 。 若需 EDTA 溶液 500ml， 而 m(EDTA)=1 l0-3mol/L 0.5L292.25g/mol=0.1461g 。即称取0.1461g 的 EDTA 粉末，溶于水，定容至500ml 即可。(3)反复用蒸馏水冲洗透析袋的内部及外部。(4)放在 lmmol/L EDTA(pH8.0)中将透析袋煮沸10 分钟。(5)冷却后， 存放于 4冰箱内， 必须确保透析袋始终完全浸没在溶液内。从此时起取用透析袋时总须戴手套。(6)使用透析袋前在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净。
10、注：步骤 4，用 lmmol/L EDTA(pH8.0)煮沸 10 分钟的操作， 可代之以将透析袋装于盛满水松盖瓶内，在201bf/in2(1.379 105Pa)高压下蒸汽灭菌l0 分钟。2DEAE-32 纤维素预处理：称取DEAE-32 纤维素 18g，采用以下方法前处理：(1)加 180mL 离子水于DEAE-32 纤维素中，浸泡溶胀24 小时。(2)倾去凝胶溶胀后凝胶上层的水，加入凝胶等体积的1.0mol/L HCl 液处理，用搅棒轻轻搅动，并浸泡0.5 小时预处理后倾去。用去离子水洗涤至中性。(3)倾去凝胶上层的水及悬浮碎片后，加入凝胶等体积的1.0mol/L NaOH 液处理，用搅
11、棒轻轻搅动，并浸泡0.5 小时处理后，用去离子水洗涤。洗涤过程中，用倾去法去细颗粒。(4)重复步骤2 的操作。(5)倾去凝胶上层的水后，加入凝胶等体积的0.0lmol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液，用搅棒轻轻搅动平衡。倾去凝胶上层的TrisHCl 缓冲液，重复平衡3 次。(6)将 DEAE-32 纤维素凝胶溶液盛放于抽滤瓶中，用洗耳球塞住杯口，减压抽气30 分钟，除去凝胶溶液内的气泡。将脱气后的凝胶溶液轻轻倒入盛有Tris-HCl 缓冲液的烧杯中，备用。3、提取步骤 ：1取东亚钳蝎剪尾，分别对蝎尾和蝎身称重，高速组织捣碎机进行捣碎，加入 5 倍蝎尾和蝎身重量体积 (V/W) 的磷酸钠
12、缓冲液，预冷，磁力振荡搅拌器搅拌30 分钟， 4浸提过夜。2滤液在4下 8000r/min 离心 20 分钟，取上清液，即为蝎尾蝎身粗提液。3采用 (NH4)：S04溶液饱和度的方法，分别以40、 70的盐饱和度对蝎尾蝎身蛋白质粗提液进行分段盐析，硫酸铵溶液饱和度的计算参见表2-1。参照表 2-1 计算 4096 硫酸铵饱和度需要硫酸铵的质量，缓慢加入到蝎尾蝎身粗提液中，4预冷，放在磁力搅拌器上搅拌30 分钟使硫酸铵完全溶解，4静置 l 小时，然后在4条件下 8000r/min 离心 20 分钟，手机上清液。采用同样方法调整硫酸铵饱和度到70进行盐析，收集沉淀，用磷酸钠缓冲液溶解，4保存，备用
13、。4把收集得到的待测液装入预先处理好的45mm 透析袋中，先用双蒸水4透析 4 小时，然后用 Tris-HCl 缓冲液进行透析，中间多次换缓冲液，至到用氯化钡溶液检测不出白色硫酸钡沉淀为止。5把透析完的透析袋放到聚乙二醇10000 中进行浓缩，过滤浑浊的待测液，4保存备用。最后用沸水煮用过的透析袋二十分钟，然后放入双蒸水中，冰箱保存即可重复使用，聚乙二醇放入烘箱蒸干其水分以便下次使用。怀头鲇胃黏膜蛋白酶分离提纯条件的筛选刘伟，曾真，战培荣胃蛋白酶的粗提(粗分级 )1)采样时间。怀头鲇胃黏膜蛋白酶活性在摄食后3 h 达到高峰，故在喂食后34 h 进行采样。2)酶原抽提。在冰盘上解剖怀头鲇并剪下整
14、个胃部，用蒸馏水清洗，再剪去胃外壁肌肉，保留内壁黏膜组织。 将黏膜组织剪碎， 加入 4 倍质量的双蒸水， 用高速匀浆器以10 00013 000 r/min 低温匀浆2 h(每 5min 间歇匀浆l min)。若匀浆中有较多组织碎块，应尽可能剪碎黏膜组织。再将匀浆液以8 000 r/min 冷冻离心 15 min，上清即为胃蛋白酶原抽提液，蛋白酶活力为 0.516 IU/mg 。3)酶原激活。用1 mol/L 的盐酸将胃蛋白酶原抽提液pH 调至 2.8，静置 2 h，酶原被激活为有活性的蛋白酶， 即胃蛋白酶激活液， 蛋白酶活力为61 95IU/mg 。 将胃蛋白激活液用1 mol/L的氢氧化钠
15、溶液调节pH 至 4.2，并于 4下保存。人单核细胞表面晚期氧化蛋白产物结合蛋白的分离孙岩晚期氧化蛋白产物的制备分离AOPP 的形成主要依赖于氯化氧化剂，特别是 HOCI 的作用，而在血浆中， HSA 是形成 AOPP最主要的蛋白组分，因此目前主要通过HSA-HOCI孵育法由体外制备AOPPf 称为 AOPP -HSA) 。我们首先以此种方法制备AOPPHSA 粗纯品， 继而先后通过Sephadex G-100 凝胶层析和 MonoQ 阴离子交换一HPLC 分离其中I 鬟 JAOPPHSA ，测定其纯度。材料一、主要仪器l、Orion 868pH 计英国 Thermo 2、Ultrospec
16、4300 pro 紫外 /可见光分光光度计美国3、深低温冰箱日本SANYO 4、Biologic LP 低压层析系统美国Bio-Rad 5、负压冷冻机英国Thermo 6、Water484 HPLC 系统美国Waters 7、SUMMIT HPLC系统德国戴安8、EDS-99 细菌内毒素定量测定系统湛江安度斯公司二、主要试剂1、次氯酸钠 (NaOCl) 重庆北碚化学试剂厂2、乙二胺四乙酸(EDTA) 上海生工3、人血清白蛋I 刍(HSA) 美国 Sigma 4、碘化钾 (KI) 重庆化学试剂厂5、醋酸重庆北碚化学试剂厂6、氯胺 -T 天津天泰精细化学品有限公司7、牛血清白蛋白(BSA) 美国 Sigma 8、考马斯亮蓝G-250 上海生工9、Sephadex G-100 凝胶美国 Pharmacia 10、 Mono-Q HR 5/5 阴离子交换柱美国Pharmacia 1l、C8 分析柱德国戴安12、三氟乙酸 (TFA) 美国 Sigma 13、乙腈美国Sigma 14
