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1、生物化学,第十三章 基因工程与常用的分子生物学技术,浙江医学高等专科学校 王黎芳,学习目标,1.掌握：基因工程的概念。 2.熟悉：基因工程的基本原理和临床应用；熟悉基因诊断、基因治疗等新医疗方法。 3.了解：常用分子生物学技术的分类和应用。 4.对临床上的一些分子生物学新技术能有所知晓。 5.培养学生的自主学习、查阅文献资料的能力。,第十三章 基因工程与常用的分子生物学技术,第一节 基因工程 第二节 常用分子生物学技术及应用,第一节,基 因 工 程,一、重组DNA技术的基本概念,二、重组DNA技术的原理和过程,第一节 基因工程,三、重组DNA技术在医学中的应用,基因工程(重组DNA技术)指分离
2、目的基因片段，经过剪接后连接到载体上构成重组体，导入宿主细胞后在宿主细胞内进行表达。核心是DNA片段的重组和细胞克隆,一、基本概念,（一）定义,外源核酸分子在宿主细胞中进行复制，跨越了天然物种屏障少量目的基因片段在寄主细胞中实现大量扩增,（二）特点,基因工程主要技术程序 1）目的基因的分离、克隆； 2）表达载体的构建； 3）外源基因导入宿主细胞； 4）外源基因在宿主基因组上的整合、表达及检测； 5）外源基因表达产物的分离、纯化和活性检测。,二、原理与过程,载体,酶切,目的基因,酶切,连接,宿主细胞,重组子,连接,连接,转化,鉴定、表达,分离、纯化,（一）目的基因,目的基因是基因工程中需要研究的
3、那段基因，是准备要分离、改造、扩增或表达的基因。,1.定义,制备目的基因方法包括人工合成法、基因组文库、cDNA文库、PCR或RT-PCR、转座子标签法、差异显示法等。,2.制备方法,在已知目的基因的核苷酸序列后，按该碱基序列合成一段段含少量（1015个）核苷酸的DNA片段，再利用碱基互补配对的原则形成双链片段，通过连接酶将这些双链片段逐个按顺序连接起来得到一个完整的目的基因。 适用于已知核苷酸序列、分子量较小的目的基因的制备；不适用于序列复杂、目前尚不知道核酸序列的基因,1.人工合成法,染色体DNA提取,连接,无数DNA片段,载体,剪切,无数重组子,细菌,转化,基因文库,分子杂交,筛选得到目
4、的基因片段,2.从基因文库中钓取,mRNA提取,连接,cDNA,载体,逆转录,重组子,细菌,转化,cDNA文库,3.构建cDNA文库,聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外合成特异的DNA片段的一种方法。,4.聚合酶链式反应,DNA模板,第一个循环,第二个循环,21,22,第n个循环,2n,n=35个循环,235个目的基因分子,用于基因工程的载体主要包括质粒、噬菌体、粘粒（又称柯斯质粒 Cosmid）、其他病毒载体、细菌人工染色体（BAC）载体和酵母人工染色体（YAC）载体等。,（二）载体,质粒是细菌或细胞质中，独立于染色质的共价闭环小分子双链DNA
5、，能自主复制，与细菌或细胞共生。,1.质粒载体,氨苄青霉素抗性基因（AmpR）,Eco RI,Hind III,多克隆位点（MCS）,Lac Z,Lac I,启动子 （promotor）,复制起始点（Ori V）,pUC 19 质粒载体,噬菌体是感染细菌的一类病毒，其基因组分为三个部分，左右臂包含DNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、溶菌生长所需的全部DNA序列；中段编码溶菌生长所需的蛋白质。 利用噬菌体作载体，主要是将外来目的DNA替代或插入中段序列，与左右臂一起包装成噬菌体，感染宿主细胞。,2.Lambda （）噬菌体载体,噬菌体载体对外源基因的容量更大，可以插入的片段大小可以达
6、到20几kb。 由于是体外包装成噬菌体颗粒再感染宿主细胞，较之于质粒DNA的直接转化，效率更高。 噬菌体载体宿主的选择面较窄，在操作的安全性上比质粒DNA有优势。,兼具质粒和噬菌体载体双重特点的大容量载体。含有质粒的复制起始区和筛选标记（Ampr和Tetr）。,3.柯斯质粒,限制性核酸内切酶是一类能识别并切割双链DNA分子内部特异序列的酶。,（三）工具酶,1.限制性核酸内切酶,G,A,T,T,C,A,C,T,G,C,A,G,G,T,T,A,A,C,C,T,T,A,A,G,G,A,A,A,T,T,G,C,C,G,T,C,Eco R I,Pst I,Hpa I,5,5,5,5,5,3,5,3,3,
7、3,3,3,TTAA,TTAA,AATT,TTAA,TTAA,AATT,AATT,TTAA,DNA连接酶,包括T4噬菌体DNA连接酶、T4噬菌体RNA连接酶、大肠埃希菌DNA连接酶,2.连接酶,DNA连接酶通过催化DNA链的5-PO4与相邻的另一DNA链的3-OH生成3,5-磷酸二酯键而封闭DNA链上的缺口。,+,重组体的构建是通过DNA连接酶催化将限制性核酸内切酶酶切过的目的基因与合适的载体连接，形成重组的DNA分子（重组体）的过程。,（四）重组体的构建,（五）重组DNA导入宿主细胞,不同的载体对应有不同的宿主细胞，导入的方法也不尽相同，包括：转化、转导和转染等。,（六）转化子的筛选,常用的
8、筛选方法 1) 抗生素筛选法,+,或,连接,蓝色菌落,白色菌落,载体,外源基因,非重组子,重组子,转化 宿主菌,菌落生长,菌落不生长,2) 互补法,（七）目的基因的表达,基因重组的目的之一使目的基因在宿主细胞中高效表达 表达产物为生命科学研究、医药或商业所用,三、重组DNA技术在医学中的应用,（一）基因工程制药,临床治疗用的重组蛋白包括：免疫性蛋白，如一些抗原和单克隆抗体；细胞因子，如各种干扰素、集落刺激生长因子等；激素，如胰岛素、心钠素；各种酶类，如尿激酶、链激酶；,（二）疾病的发现和诊疗,应用于遗传病、肿瘤、心脑血管疾病、病毒细菌寄生虫病和职业病等的诊断,重组人胰岛素 胰岛素是治疗糖尿病的
9、特效药。长期以来，只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，产量低、价格高，堪比黄金。将合成的胰岛素基因导入大肠埃希菌，实现基因工程制药后，每2000L培养液就能分离纯化得到100g胰岛素蛋白。大规模工业化生产解决了药品的产量问题，将药品价格降低了30%-50%。,知识拓展,第二节,常用分子生物学技术及应用,一、核酸原位杂交,二、聚合酶链式反应,第二节 常用分子生物学技术及应用,三、印迹技术,四、分子生物学技术的临床应用,一、核酸原位杂交,核酸原位杂交是用序列已知的、特定标志标记过的核酸作为探针，与细胞或组织切片中的核酸碱基互补配对进行复性杂交，形成专一的杂交
10、分子，通过探针上的标记将待测核酸在细胞、组织中的位置显示出来。,二、聚合酶链式反应,聚合酶链式反应是在体外将微量的目的基因片段大量扩增，以得到足量的DNA供研究分析和检测鉴定用的技术。 PCR技术的基本原理与体内DNA的复制过程相似,1.定义,（一）工作原理,由变性-退火-延伸三个步骤构成： 1）变性： 93孵育一定时间，模板DNA双链变性为单链； 2）退火（复性）：温度下降至适宜温度，模板DNA单链与引物碱基互补配对，形成DNA单链模板-引物复合物；退火温度一般是目的基因片段Tm值再减5。 3）延伸：温度上升至72，复合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为原料，单链序列为模板，在引
11、物3-OH端延伸出一条新的与模板DNA链互补的链。,2.过程,94 变性,54 退火,72 延伸,模板DNA,引物,dNTP,n个循环,PCR基本流程,Taq酶的发现 Taq聚合酶是由台湾科学家钱嘉韵女士分离得到的。1973年，钱嘉韵就读于美国俄亥俄州辛辛那提大学生物系，她的导师对黄石公园里温泉中发现的嗜热菌（水生栖热菌）十分好奇，就让钱嘉韵以该细菌作为研究主题。研究过程中，钱嘉韵成功分离出耐高温的Taq DNA聚合酶。 早先的PCR反应用的是大肠埃希菌DNA聚合酶，由于不耐变性阶段的高温，每个循环结束都需额外加酶。而Taq聚合酶可以耐受90以上的高温而不失活，大大简化了PCR技术，使之得以大
12、量应用。,知识拓展,（二）衍生技术及应用,1.原位PCR在组织细胞里进行PCR反应，将扩增的目的片段在组织细胞中定位。2.多重PCR是在同一PCR体系中加入多对引物，扩增同一模板的几个区域，或不同的目的基因。,3.逆转录PCR将RNA链逆转录成为cDNA，再以此为模板通过PCR进行目的基因的扩增。,4.荧光定量PCR是在PCR在扩增时除了加入引物还加入特异性的荧光探针。,三、印迹技术,印迹技术是以凝胶分离生物大分子后，将之直接放在或转移至固定化介质上加以检测分析的技术。 包括DNA印迹技术、RNA印迹技术和蛋白质印迹技术,（一）Southern印迹杂交,Southern印迹杂交（Souther
13、n blot）即DNA印迹技术 用限制性核酸内切酶消化DNA，得到诸多片段，经琼脂糖凝胶电泳分离后，将胶上的DNA片段变性并原位转印到尼龙膜等固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定。用带有标记的DNA探针与这些片段进行杂交后显影或显色。通过条带的有无或深浅来进行DNA的定性与定量。,限制性核酸内切酶酶切,全长DNA,DNA片段,琼脂糖 凝胶电泳,分离了DNA片段的凝胶,吸附有DNA片段的膜,转膜,杂交,显影,带标记的DNA探针,Southern印迹杂交基本流程,（二）Northern印迹杂交,Northern印迹杂交（Northern blot）即RNA印迹技术。 技术原理与Southern印
14、迹杂交一致。 Northern印迹杂交通过检测RNA的量来研究基因的表达情况。,（三） Western印迹法,Western印迹法（Western Blot）即蛋白质印迹技术 与Southern或Northern杂交方法类似，但电泳的介质是聚丙烯酰胺凝胶，被检测的是蛋白质，“探针”则是抗体，用带标记的抗一抗的抗体（二抗）显色。 通过分析条带位置和着色深度检测目的蛋白质在组织细胞中的表达情况。,聚丙烯酰胺凝胶电泳,分离了蛋白质的凝胶,吸附有DNA片段的膜,转膜,杂交,显色,Western印迹杂交基本流程,变性,一抗,二抗,四、分子生物学技术的临床应用,（一）基因诊断,基因诊断是借助分子生物学和分
15、子遗传学的技术，检测遗传物质结构变化或表达水平是否异常的临床辅助诊断方法。核酸分子杂交是最常用的基因诊断方法之一,（二）基因治疗,基因治疗是利用分子生物学方法将外源正常基因导入患者的细胞内，以纠正、补偿由于基因缺陷或异常而引起的疾病，达到治疗和预防疾病的目的。,根据靶细胞的不同，基因治疗分为两种： 1）种系基因疗法：将修改后的功能基因整合入生殖细胞（精子或卵子）的基因组中。这种治疗方法可以遗传，但限于技术与伦理学问题，目前仅限于动物实验。 2）体细胞基因治疗：将功能基因转染到患者的体细胞内。这种改变并不会遗传，对任何基因的修改和产生的效果都将只体现在接受治疗的患者身上。,根据Morgan RA, Dudley ME, Wunderlich JR, et al. Cancer regression in patients after transfer of genetically engineered lymphocytes. Science. 2006;314(5796):126-9. 画图,
