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1、植物体内可溶性蛋白质含量的测定植物体内的可溶性蛋白质含量是一个重要的生理生化指标，如在研究每一种 酶的作用时常以比活 (酶活力单位毫克蛋白质，unITMg ProTeIn)表示酶活力 大小及酶制剂纯度，这就需要测定蛋白质含量。常用的测定方法有LoWry 法和 考马斯亮蓝 G250 染色法，本实验将分别介绍这两种方法。方法一： LoWry 法(劳里法)【原理】LoWry 法是双缩脲法 (BIureT)和福林酚法 (olIn酚)的结合与发展。其原理是蛋 白质溶液用碱性铜溶液处理后， 碱性铜试剂与蛋白质中的肽键作用产生双缩脲反 应，形成铜 蛋白质的络合盐。再加入酚试剂后，在碱性条件下，这种被作用的
2、蛋白质上的酚类基团极不稳定，很容易还原酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸 (PHosPHoMolyBdATe PHosPHoTungsTATe)，使之生成磷钨蓝和磷钼蓝的混 合物。这种溶液蓝色的深浅与蛋白的含量成正相关，所以可以用于蛋白质含量的 测定。 LoWry 法除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲 法中肽键的显色效果更强烈， 其显色效果比单独使用酚试剂强315倍，约是双 缩脲法的 100 倍。由于肽键显色效果增强， 从而减少了因蛋白质种类不同引起的 偏差。 LoWry 法适于微量蛋白的测定，对多个样品同时测定较为方便。但对不 溶性蛋白和膜结合蛋白必须进行预处理(如加入少量的 SD
3、S)。1.双缩脲法的原理双缩脲 (NH2-CO-NH-CO-NH2) 在碱性溶液中可与铜离子产生 紫红色的络合物， 这一反应称为双缩脲反应。 因为蛋白质中有多个肽键， 也能与 铜离子发生双缩脲反应， 且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比 尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关，所以可用双缩脲法测定蛋白质 的含量。双缩脲反应主要涉及肽键， 因此受蛋白质特异性影响较小。 且使用试剂价廉易得， 操作简便，可测定的范围为110Mg 蛋白质，适于精度要求不太高的蛋白质含 量的测定，能测出的蛋白质含量须在约0以上。双缩脲法的缺点是灵敏度 差、所需样品量大。 干扰此测定的物质包括在性质上是氨
4、基酸或肽的缓冲液，如 TrIs 缓冲液，因为它们产生阳性呈色反应，铜离子也容易被还原，有时出现红色 沉淀。2.福林-酚法的原理该方法是双缩脲法的发展，包括两步反应：(1)在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质铜络合物。(2)此络合物将试剂磷钼酸 磷钨酸 (olIn 试剂)还原， 混合物深蓝色 (磷钼蓝和磷 钨蓝混合物 )，颜色深浅与蛋白质含量成正比。此方法操作简便，灵敏度比双缩 脲法高 100 倍，定量范围为 5100g 蛋白质。 olIn 试剂显色反应由酪氨酸、 色氨酸、半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物，均有干 扰作用。此方法的缺点是有蛋白质的特异性影响，即不同蛋白质因
5、络氨酸、 色氨 酸含量的不同而使显色强度稍有不同，标准曲线也不是严格的直线形式。【仪器与用具】试管若干；刻度移液管0支，1Ml 1 支，10Ml 1 支；定量加样器；圆底烧 瓶；冷凝管 1 套(带橡胶管 )；微量滴定管；小烧杯；微量进样器50l 1支；721 分光光度计；恒温水浴器；研钵；玻棒；离心机；离心管。【试剂】NA2WO4 2H2O；NA2MoO4 2H2O；85H3PO4；浓 HCl；LI2SO4 H2O；溴水； 酚酞指示剂； NA2CO3；NAOH；CuSO4 5H2O；酒石酸钾钠；牛血清白蛋白。 所用试剂均为化学纯或分析纯。【方法】1试剂的配制(1)碱性铜试剂 (相当于双缩脲试剂
6、 )的制备首先配制 A 液：4碳酸钠 (NA2CO3) 溶液与 0L 氢氧化钠 (NAOH) 溶液等比例混合 (2NA2CO3，0 NAOH)；B 液：1硫酸铜 (CuSO4 5H2O)溶液与 2酒石酸钾钠溶液等比例混合 (0CuSO4 5H2O，0.1酒石酸钾钠 )。在使用前将 A 液与 B 液按 501 的比 例混合即成。此为 olIn酚试剂甲液，此试剂只能使用1 天。酚试剂 (相当于 olIn 试剂)的配备：称取钨酸钠 (NA2WO4 2H2O)100g、钼酸钠 (NA2MoO4 2H2O)25g，加蒸馏水 700Ml 溶解于 1500Ml 的圆底烧瓶中。之后加 入 85的 H3PO45
7、0Ml，浓 HCl 100Ml ，安上回流装置 (使用磨口接头，若用软木 塞或橡皮塞时，就必须用锡铂纸包起来)，使其慢慢沸腾 10H。冷却后加入硫酸 锂(LI2SO4 H2O)150g，水 50Ml，溴水 23 滴，不用回流装置开口煮沸15Min， 以释放出过量的溴。待冷却后稀释至1000Ml，并过滤入棕色瓶中，密闭于冰箱 中保存 (冷却后溶液呈黄色，倘若仍呈绿色，须再滴加数滴液体溴，继续煮沸 15Min)。使用时用标准 NAOH 溶液滴定，以酚酞作为指示剂，滴定终点由蓝变 灰，滴定后算出酸的浓度。 使用时大约加水 1 倍，使最终浓度相当于 1MolL H 酸，此为 olIn酚试剂乙液 (ol
8、In 试剂)。在测定时要注意，因为酚试剂仅在酸性条件下稳定，但此实验的反应只在PH 值 为 10 的情况下发生，所以当加酚试剂时，必须立即混匀，以便在磷钼酸磷钨 酸试剂被破坏前即能发生还原反应，否则会使显色程度减弱。（2）标准蛋白质溶液的配制称取 25mg牛血清白蛋白， 溶于 100Ml 蒸馏水中， 使最终浓度为 250g Ml 。2标准曲线的绘制（1）取 7 支试管，编号后，分别加入0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、 1.0ml 标准蛋白质溶液，用蒸馏水补足1Ml，使每管含蛋白量分别为0g、25g、 50g、100g、150g、200g、250g( 必要时可
9、做重复 )。(2)在每支试管中用定量加样器加入5Ml 甲液，混匀，于 30下放置 10Min。(3)在每支试管中喷射加入0乙液，立即振荡混匀，在30下保温 30Min。(4)准确到 30Min 后，以不加标准蛋白试管中的溶液为空白，在 500nM 下用 1CM 光径的比色杯对系列标准蛋白溶液进行比色，测定光密度值。以蛋白浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。3样品的测定(1)样品的提取：称取鲜样0，用 5Ml 蒸馏水或缓冲液研磨提取。取 1视蛋白质含量适当稀释 )样液加入试管中，然后重复步骤2 的(2)、(3)、 (4)，以标准曲线中的0 管为空白，测定吸光值。(2)根据吸光值查标准曲
10、线，求出比色液中的蛋白质含量。4结果计算样品中蛋白的含量 (Mgg)C VTV1 FW 1000(2-1）式中 C:查标准曲线值 (g) ；VT:提取液总体积 (Ml) ；W:样品鲜重 (g)；V1:测定时加样量 (Ml) 。【注意】还原物质，其他酚类物质及柠檬酸对此反应有干扰。方法二：考马斯亮蓝G250 染色法【原理】考马斯亮蓝 G250(GooMAssIe BrIllIAnT Blue G 250)测定蛋白质含量属于染 料结合法的一种。考马斯亮蓝G250 在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中，当 它与蛋白质的疏水区结合后变为青色， 前者最大光吸收在 465nM， 后者在 595nM。 在一定蛋
11、白质浓度范围内(1100g) ， 蛋白质与色素结合物在595nM 波长下的光 吸收与蛋白质含量成正比， 故可用于蛋白质的定量测定。 蛋白质与考马斯亮蓝G 250结合在 2Min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室 温下 1H 内保持稳定。 该反应快速灵敏 (灵敏度比 olIn酚法还高 4 倍)、易于操 作、干扰物质少 (考马斯亮蓝 G250 和蛋白质通过范德华力结合， 受蛋白质的特 异性影响较小，除组蛋白外，其他不同种类蛋白质染色强度差异不大)，可测定 微克级蛋白质含量， 是一种比较好的蛋白质定量法。但此方法也存在其缺点， 考 马斯亮蓝在蛋白质含量很高时线性关系偏低，且不同来
12、源蛋白质与色素结合状况 有差异。【仪器与用具】721 分光光度计； 10Ml 量筒 1 个；研钵；烧杯；量瓶；移液管：1Ml 3 支，0 3 支；10Ml 具塞刻度试管 14 支。【试剂】标准蛋白质溶液：用牛血清白蛋白配成含蛋白质100gMl 的标准蛋白溶液 ;90乙醇；85磷酸 (WV)；考马斯亮蓝 G250 溶液：称取 100g 考马斯亮蓝 G250，溶于 50Ml 90乙醇 中，加入 85的磷酸 100Ml，最后用蒸馏水定容到1000Ml，贮放在棕色瓶中， 此溶液在常温下可放置1 个月。【方法】1标准曲线 (蛋白质含量为 0100gMl) 的绘制取 6 支具塞试管，按表21 数据配制含
13、0100gMl 的牛血清蛋白质液各1Ml。表 21 不同蛋白质含量的牛血清蛋白质液配制表管号 123456 蛋白质标准液（ ml)00.200.400.600.801.00蒸馏水 （ml)1.000.800.600.400.200蛋白质含量（ g）020406080100在每支试管中加入 5Ml 考马斯亮蓝 G250溶液，盖塞，反转混合数次，放置2Min 后，用 1CM 光径比色杯在 595nM 下比色。以蛋白质浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制标 准曲线。2.样品提取液中蛋白质浓度的测定吸取样品提取液 1.0Ml(样品提取见 LoWry 法)，放入具塞试管中 (每个样品设置两个重复 )，加入
14、 5Ml 考马斯亮蓝 G250 溶 液，充分混合，放置 2Min 后在 595nM 下比色，记录吸光值，并通过标准曲线查 得蛋白质含量。3结果计算样品中蛋白质的含量 (Mgg)C VTV1 FW 1000（2-2）式中C：查标准曲线值 (g) ；VT：提取液总体积 (Ml) ；W：样品鲜重 (g)；V1：测定时加样量 (Ml) 。植物叶片可溶性蛋白含量测定注意点：1，考马斯亮蓝 G-250所配溶液不稳定，所以每次实验都必须新配，且必须新做标准曲线；2，考马斯亮蓝 G-250配制完毕，如果发现溶液中有絮状沉淀，可以试用滤纸过滤后使用，如果实验中发现使用过滤后的考马斯亮蓝G-250 溶液在与样品接
15、 触后短时间内便又发生絮凝， 基本上推测该考马斯亮蓝G-250过期（比较容易出现）。原理植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类，测其含量是了解植 物体总代谢的一个重要指标。 在研究每一种酶的作用时， 常以比活（酶活力单位mg蛋白）表示酶活力大小及酶制剂纯度。因此，测定植物体内可溶性蛋白质 是研究酶活的一个重要项目。 常用测定方法有 Lowry 法和考马斯亮蓝 G-250 染料结合法。 考马斯亮蓝 G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光 吸收在 465nm ，后者在 595nm 。在一定蛋白质浓
16、度范围内（0100g/ml ），蛋 白质色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合在 2min 左右的时间内达到平衡， 完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h 内保持稳定。该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。试剂（1）牛血清白蛋白配成 100g/ml ； （2）考马斯亮蓝 G-250：称取 100mg考马斯亮蓝 G-250溶于 50ml 90%乙醇中，加入 85% （W/V ）磷酸 100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml。此溶液在常温 下可放置一个月； （3）90% 乙醇； （4）磷酸（ 85% ，W/V ）。方法1.标准曲线的绘制（1）0100g/ml 标准曲线的制作取 6 支试管，按表 28-1 数据配制 0 100g/ml 血清白蛋白液各
