花季雨季经典句子：原谅我不是个手凉之人

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1、生物技术制药-07,第七章 酶工程制药,http:/ 酶工程制药,第一节 概述 第二节 酶的来源和生产 第三节 酶和细胞的固定化 第四节 固定化酶和固定化细胞的反应器 第五节 酶工程在医药工业中的应用 第六节 酶工程研究的进展,第一节 概述,一、酶的特性 酶、酶促反应的定义 酶除具有一般催化剂的共性外，还有其特有的特点：催化效率高；专一性强；反应条件温和；酶的催化活性受到调节和控制。 1961年按酶所催化的反应类型将酶分成6大类：氧化还原酶类； 转移酶类； 水解酶类；裂合酶类； 异构酶类；合成酶（或称连接酶）类。,二、酶工程简介,酶工程是酶学和工程学相互渗透结合、发展而形成的一门新的技术科学。

2、它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异性催化功能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。 20世纪20年代初：酶工程名称出现于自然酶制剂在工业上的大规模应用； 1953年，羧肽酶、淀粉糖化酶、胃蛋白酶和核糖核酸酶等用重氮化聚氨基聚苯乙烯树脂进行固定。 1969年，固定化酶技术拆分DL-氨基酸 1971年，1st国际酶工程会议：酶的生产、分离纯化、酶的固定化、酶及固定化酶的反应器、酶及固定化酶的应用等。,二、酶工程简介,从现代观点来看，酶工程主要有以下几个方面的研究内容：酶的分离、提纯、大批量生产及新酶和酶的应用开发；酶和细胞的固定化及酶反应器的研究（包括酶传感器、反应检测等）；酶生产中

3、基因工程技术的应用及遗传修饰酶（突变酶）的研究；酶的分子改造与化学修饰、以及酶的结构与功能之间关系的研究；有机相中酶反应的研究；酶的抑制剂、激活剂的开发及应用研究；抗体酶、核酸酶的研究；模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成的研究。,第二节 酶的来源和生产,一、酶的来源 酶的来源主要是动植物和微生物，动植物细胞培养的方法可用于酶生产，目前工业化生产一般以微生物为主要来源。利用微生物生产酶的优点是：微生物种类繁多，动植物体内存在的酶，几乎都可从微生物中得到；微生物繁殖快、生产周期短、培养简便，并可以通过控制培养条件来提高酶的产量；微生物具有较强的适应性，通过各种遗传变异的手段，能培育出新的高产菌

4、株。,二、酶的生产菌,1、对菌种的要求： （1）产酶量、酶的性质、最好是胞外酶；（2）不是致病菌；（3）稳定，不易产生变异退化，不易感染噬菌体；（4）能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。 2、生产菌的来源：菌种保藏机构和有关研究部门，但大量的工作应是从自然界中分离筛选菌样采集、菌种分离初筛、纯化、复筛和生产性能鉴定等。还应包括改良（如基因突变、基因转移和基因克隆）。 3、目前常用的产酶微生物：大肠杆菌、枯草杆菌、啤酒酵母、青霉菌、木霉菌、根霉菌链霉菌等。,第三节 酶和细胞的固定化,酶反应几乎都在水溶液中进行，属均相反应，自然简便，但缺点是游离酶只能一次性使用，不仅造成酶的浪费，而且会增加产

5、品分离的难度和费用，影响产品的质量；另外溶液酶很不稳定，容易变性和失活。将酶制剂制成既能保持其原有的催化活性、性能稳定、又不溶于水的固形物，即固定化酶，则可象一般固定催化剂那样使用和处理，就可以大大提高酶的饿利用率。与酶类似，细胞也能固定化，固定化细胞既有细胞特性和生物催化的特性，也具有固相催化剂的特点。,一、固定化酶的制备,1、固定化酶的定义：是指限制或固定于特定空间位置的酶，具体来说，是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。制备固定化酶的过程叫做酶的固定化。固定化所采用的酶，可以是经提取分离后得到的有一定纯度的酶，也可以是结合在菌体（死细胞

6、）或细胞碎片上的酶或酶系。,2、固定化酶的特点：酶类可粗分为天然酶和修饰酶，固定化酶属于修饰酶，修饰酶类还包括经过化学修饰的酶和用分子生物学方法在分子水平上进行改良的酶等。固定化酶最大特点是既具有生物催化剂的功能，又具有固相催化剂的特性。固相酶还具有以下优点：可多次使用，而且在多数情况下，酶的稳定性提高。如固定化的葡萄糖异构酶可以在6065条件下连续使用超过1000h；反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残留酶，易于纯化，产品质量高；反应条件易于控制，可实现转化反应的连续化和自动控制；酶的利用效率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量减少；比水溶性酶更适合于多酶反应。,3、酶和细胞的固定化方法

7、 酶的固定化就是通过载体将酶限制或固定于特定的空间位置，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。 由于酶的空间结构、活性位点等物理化学特性不同，因此并不是一种固定化技术就能普遍适用于每一种酶，所以要根据酶的应用目的和特性，来选择其固定化方法。 目前已建立的各种各样的固定化方法，按所用的载体和操作方法的差异，一般可分为载体结合法、包埋法及交联法3类，细胞固定化还有选择性热变性（热处理）方法。,酶和细胞的固定化方法,载体结合法,交联法,包埋法,热处理（细胞）,物理吸附法,共价结合法,网格型,微囊型,离子结合法,（1）载体结合法,载体结合法是将酶结合于不溶性载体上的一种固定化

8、方法。 物理吸附法：是用物理方法将酶吸附于不溶性载体上的一种固定化方法，此类载体有无机载体、天然高分子、大孔型合成树脂、疏水型的载体。物理吸附法的缺点在于最适吸附酶量无规律可循，不同载体和不同酶其吸附条件也不同，吸附量与酶活力不一定呈平行关系，同时酶与载体之间的结合力不强，酶易于脱落，导致酶活力下降并污染产物。此法也可固定细胞；,（1）载体结合法,离子结合法：是通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体上的固定化方法。此类载体有多糖类离子交换剂和合成高分子离子交换树脂，如DEAE-纤维素、Amberlite CG-50、XE-97、IR-45和Dowex-50等。操作简单、酶的高级结构和活性

9、中心的氨基酸不易被破坏，能得到酶活回收率较高的固定化酶。但是载体与酶的结合力比较弱，容易受缓冲液种类或vpH的影响，在离子强度高的条件下进行反应时，往往会发生酶从载体上脱落的现象。此法也可用于微生物细胞的固定化，细胞有自溶现象。,（1）载体结合法,共价结合法： 共价结合法是酶以共价键结合于载体上的固定化方法，也就是将酶分子上非活性部位功能团与载体表面反应基团进行共价结合的方法。它是研究最广泛、内容最丰富的固定化方法，其原理是酶分子上的功能团，如氨基、羧基、羟基、咪唑基、巯基等和载体表面的反应基团之间形成共价键，因而将酶固定在载体上。 共价结合法有数十种，如重氮化、迭氮化、酸酐活化法、酰氯法、异

10、硫氰酸酯法、缩合剂法、溴化氰活化法、烷基化及硅烷化法等。 在共价结合法中必须首先使载体活化，即使载体获得能与酶分子的某一特定基团发生特异反应的活泼基团；另外要考虑到酶蛋白上提供共价结合的功能团不影响酶的活性；反应条件尽可能温和。,共价结合法的优缺点,共价结合法与离子结合法和物理吸附法相比，反应条件苛刻，操作复杂，而且由于采用了比较强烈的反应条件，会引起酶蛋白高级结构的变化，破坏部分活性中心，因此往往不能得到比活性高的固定化酶，甚至酶的底物专一性等性质也会发生变化。但是酶与载体结合牢固，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落。,（2）交联法,交联法是用双功能或多功能试剂使酶与酶或微生物的

11、细胞与细胞之间交联的固定化方法。交联法有可分为交联酶法、酶与辅助蛋白交联法、吸附交联法及载体交联法4种。其内容有酶分子交联、分子间交联或辅助蛋白与酶分子间交联；也可以先将酶或细胞吸附于载体表面而后再交联或者在酶与载体之间进行交联。常用的交联剂有戊二醛、双重氮联苯胺-2,2-二磺酸、1,5-二氟-2,4-二硝基苯及己二酰亚胺二甲酯等。参与交联反应的酶蛋白的功能团有N-末端的- 氨基、赖氨酸的-氨基、酪氨酸的酚基、半胱氨酸的巯基及组氨酸的咪唑基等。,交联法的优缺点,交联法的反应条件比较强烈，固定化酶的酶活回收一般较低，但是尽可能降低交联剂的浓度和缩短反应时间将有利于固定化酶比活的提高。,最常用的交

12、联剂是戊二醛，它的二个醛基与酶分子的游离氨基反应形成schiff碱，彼此交联，其方式如下： CH=N-酶-N=CH-(CH2)3-CH=N-酶=N=CH-,交联方式,N,CH,(CH2)3,CH,N,N,CH,(CH2)3,CH,N,CH=N-酶-N=CH-(CH2)3-CH=N-酶=N=CH-,交联法,一般用交联法所得到的固定化酶颗粒小，结构性能差、酶活性低，故常与吸附法或包埋法联合使用。如先使用明胶（蛋白质）包埋，再用戊二醛交联；或先用尼龙（聚酰胺类）膜或活性炭、Fe2O3等吸附后，再交联。由于酶的功能团，如氨基、酚基、羧基、巯基等参与了反应，会引起酶活性中心结构的改变，导致酶活性下降。为

13、了避免和减少这种影响，常在被交联的酶溶液中添加一定量的辅助蛋白如牛血清白蛋白，以提高固定化酶的稳定性。,(3)包埋法,包埋法分为网格型和微囊型两种。 将酶或细胞包埋在高分子凝胶网络中的称为网格型；将酶或细胞包埋在高分子半透膜中的称为微囊型。 包埋法注意事项：防止高分子聚合造成酶的失活，只适于小分子底物和产物。 网格型中用的高分子有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等合成高分子和淀粉、明胶、胶原、海藻胶和角叉菜胶等天然高分子。网格型包埋法是固定化细胞中用得最多、最有效的方法。 由包埋法制得的微囊型固定化酶通常为直径几微米到几百微米的球状体，颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物与产物的扩散，但是反应条

14、件要求高，制备成本也高,（4）选择性热变性法,专用于细胞固定化，是将细胞在适当温度下处理使细胞膜蛋白变性但不使酶变形而使酶固定于细胞内的方法。,4、酶和细胞的固定化载体,在酶的固定化过程中所用的水不溶性固体支持物为载体或基质。固定化载体必须符合一定的条件：固定化过程不引起酶变性；对酸碱有一定的耐受性；有一定的机械强度；有一定的饿亲水性及良好的稳定性；有一定的疏松网状结构，颗粒均匀；共价结合时具有可活化基团；有耐受酶和微生物细胞的能力；廉价易得。,吸附载体，主要有物理吸附和离子吸附两种，物理吸附有无机物和有机物。 包埋载体，目前工业上用的包埋载体主要有卡拉胶、海藻胶等。 共价结合载体，有纤维素、

15、Sephadex A200、琼脂、琼脂糖、苯胺多孔玻璃等。 交联法是通过双或多功能试剂进行固定化，因此不需要固定化载体。也可用与吸附法和包埋法相同的载体进行交联。,酶和细胞固定化的载体见书中表7-1,5、固定化酶的制备技术,（1）吸附法制备固定化酶技术 （2）包埋法制备固定化酶技术,（1）吸附法制备固定化酶技术,物理吸附用酶的水溶液与对此酶具有高度吸附能力的载体混合洗去杂质和未吸附的酶即得固定化酶（易脱落，故不常用） 离子交换吸附处理方法与物理吸附相同，但离子间力强（较常用）,（2）包埋法制备固定化酶技术,凝胶包埋法和微囊化包埋法： 凝胶包埋法将酶或细胞限制于高聚物网格中的技术；可以通过调节凝

16、胶材料的浓度来改变包埋率和固定化酶的机械强度。还可通过先包埋再交联的方法，使保留更坚固。 微囊化法将酶或细胞固定于不同构型的膜的外壳内的技术。包有酶的半透膜厚约20nm，膜孔径40nm，有界面沉降法和界面聚合法两种。, 界面沉降法,是物理法，其利用某些在水相和有机相界面上溶解度极低的高聚物成膜的过程将酶包埋的方法。其过程为 酶溶液在表面活性剂帮助下与水不混溶的沸点比水低的有机相中乳化将溶于有机溶剂的高聚物加入搅拌下的乳化液中加入另一种不能溶解高聚物的有机溶剂使高聚物在油水界面上沉淀、析出及成膜最后在乳化剂作用下使微囊从有机相中转移至水相，即成固定化酶。,界面聚合法,是化学法，其利用不溶于水的高聚物单体在油-水界面上聚合成膜的过程制备微囊。成膜的高聚物有尼龙、聚酰胺及聚脲等。见下例：,含酶的10%血红蛋白溶液,己甲叉二胺水溶液,+,