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1、分枝杆菌培养技术,培养目的、意义、分类,目的：分离培养临床标本中的分枝杆菌意义：诊断结核病金标准获得菌株鉴定试验纯培养物获得药敏试验所需的纯培养物疗效评估 分类： 简单法:酸性罗氏培养法 离心集菌法：中性罗氏培养法、液体培养法（如MGIT960液体培养法）,结核分枝杆菌生长要求,专性需氧菌 最适生长温度为37 最适PH为6.57.2 营养要求：氮源、碳源、无机盐（磷、铁、镁、钾、硫等）、生长因子,结核分枝杆菌生长特点,生长缓慢：在一般培养基上分裂一代需要18-24小时，一般10-30天肉眼可见菌落生长。 菌落形态（罗氏培养基）：粗糙、凸起、致密，有表面皱折，呈颗粒、结节或菜花样，浅黄色或米色，
2、不透明 （ 液体培养基：絮状或颗粒状沉淀。）,简单法操作步骤,痰标本2-3ml,12倍 4% NaOH,振荡匀化,静置15分钟,均匀接种0.1ml,2支,斜面朝上，放置24小时,37，培养8周,简单法掌握要点,1、原理 2、标本类型 3、仪器设备 4、试剂耗材 5、操作注意事项 6、结果判读 7、质量控制 8、讨论,一、原理,分枝杆菌因较厚的细胞壁有耐受酸碱的特点，能耐受碱性消化液的处理，消化液直接接种于酸性培养基上，酸性培养基能中和碱性标本处理液，分枝杆菌能在酸性的培养基上生长2%NaOH4%NaOH4%H2SO4注：不同浓度消化处理液对结核菌生长的影响,二、标本类型,痰、BF、体液（胸腹水
3、、尿液、CSF等）、大便、组织等注：标本是否留取合格不同标本类型的不同前处理过程保存方法,三、仪器设备,1、II级生物安全柜 2、恒温培养箱 3、漩涡振荡器 4、冷冻离心机 5、天平 6、高压灭菌锅,四、试剂耗材,1、 4%NaOH 2、酸性罗氏培养基成分味精（谷氨酸钠）（纯度95%以上）7.2g KH2PO4 14 g (中性2.4g) 枸橼酸镁 0.6 gMgSO47H2O 0.24 g甘油（丙三醇） 12ml蒸馏水 600ml新鲜鸡卵液 1000ml2%孔雀绿 20ml85 蒸气锅50分钟 注：配制培养基需注意的问题、注意识别不合格培养基,五、操作注意事项,视痰标本性状，加l2倍体积4氢
4、氧化钠(Na0H)消化液于痰瓶中，涡旋振荡器振荡23分钟，使痰液充分匀化，室温放置。自加入氢氧化钠消化液后起，整个处理时间不得超过20分钟。样本数较多时，应分批处理。吸取经前处理后的痰液0.1毫升，无菌操作均匀接种在整个培养基斜面。每份标本接种两支酸性罗氏培养基。接种后，37平卧放置斜面24小时。然后，拧紧培养瓶盖或塞紧试管胶塞，直立放置，37继续培养。,六、结果判读及报告,分枝杆菌培养阴性： 斜面无菌落生长。 分枝杆菌培养阳性(1十)：菌落生长占斜面面积的14。 分枝杆菌培养阳性(2十)：菌落生长占斜面面积的12。 分枝杆菌培养阳性(3十)：菌落生长占斜面面积的34。 分枝杆菌培养阳性(4十
5、)：菌落生长布满全斜面。分枝杆菌培养阴性应以 “(培养阴性)”报告，不能以“()” 表示。菌落生长不足以斜面面积14时， 实报菌落数。 （对可疑培养阳性标本，必须涂片进行抗酸染色确诊）,六、结果判读及报告,注：培养的第3天，之后每周记一次结果，对可疑的分支杆菌需涂片进行抗酸染色,七、质量控制,室内质量控制（QC） 室间质量评估（EQA） 现场评价 (on-site evaluation)：人力物力，难以日常监控 盲法复检 (blinded-rechecking)：痰标本用完难以重复 批量测试 (panel testing)：在样本准备方面还需要更多的技术投入 培养的质量保证目前主要依赖室内质量
6、控制，辅以定期或不定期的现场评价。,七、质量控制,室内质量控制人员培训、仪器设备监控、培养基无菌试验、生长试验每月对培养情况培养阳性率、涂阳培阳率和污染率的统计分析涂阳培阳率公式: 培养阳性的病例总数100%涂片检查阳性并进行培养的病例数初诊病人涂阳培阳率应大于90污染率公式: 污染的培养管数量100%培养管总数污染率应小于5%(2-5%)。,涂阳培阳率过低？,污染率过高？,总结简单法操作流程,痰标本中加入12倍体积4氢氧化钠 涡旋振荡30-60秒 室温静置15分钟 接种：0.1ml，2管 37C温箱培养水平向上培养24小时 直立放置37C继续培养 观察报告结果：第3天、7天、此后每周一次，直
7、至满8周,BACTECTMMGITTM960液体培养技术,BACTECTMMGITTM960液体培养技术,原理：,MGIT960液体培养操作步骤,痰标本2-5ml,12倍 NaOH(3%)-NALC,振荡匀化,静置15分钟,转至离心管，加PSB至45ml,3000g,离心20分钟,去上清，加1ml PBS，混悬,接种0.5ml混悬液 至快培管，上机,试剂耗材,1、6%NaOH与等量的2.9%柠檬酸钠混合液 2、N-乙酰-L-半胱胺酸（N-acetyl-L-cysteine,NALC） 100ml 6%NaOH-2.9%柠檬酸钠混合液加1gNALC 3、 PH6.8PBS 4、 BACTEC MGIT Growth Supplement(营养添加剂：葡萄糖、甘油、油酸、触酶、白蛋白、维生素B6 HCl） 5、 BBL MGIT PANTA(杂菌抑制剂：阿洛西林、萘啶酸、甲氧苄氨嘧啶、多粘菌素B、两性霉素 B) 6、 BBL MGIT 7ml 培养管,仪器设备,BACTECTMMGITTM960全自动检测系统,MGIT960的优点与缺点,优点：敏感性高时间短（平均12周左右）安全自动化检测缺点：易污染（前处理）阳性标本需进一步鉴定（MTB?NTM?污染?),
