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1、,耐药性结核病诊断新技术,1,主要内容,一、概述 二、基因芯片技术 三、熔解曲线技术,2,全球范围内结核病疫情严重患病率高： 新发患者1040万/年，其中有120万（11%）HIV患者；死亡率高：每年死亡人数达140万（13.46%），HIV/TB:死亡人数40万（33.33%）；耐药率高： 48万新发的MDR-TB病例和10万耐利福平结核病（RR-TB）病例；接受MDR检测、报告和治疗的MDR-TB不足1/3，接受治疗的MDR-TB治愈成功率只有50%,2016年全球结核病报告,3,4,2015年全球估计MDR-TB患者数,5,结核病快速及时诊断是结核病防控 重要因素,6,灵敏准确,操作简便
2、,检测时间短,闭管检测,检测位点全面,对新型耐药检测技术的要求,7,8,基因芯片技术,9,结核病耐药与基因,64-68% rps L 基因突变,70% emb B基因突变,70%,65%,耐药 基因,93%,95%,95% rpo B基因突变,利福平,异烟肼,50-70% kat G基因突变 5-10% inh A基因突变 6-13% ahp C基因启动子区域突变,链霉素,乙胺丁醇,多数研究报告提示：耐药的发生与结核杆菌的基因突变有关。总体上是基因一个或几个核苷酸突变（表现增加、缺失、替代），造成核苷酸编码错误致氨基酸错位排列，影响药物与靶位酶结合产生耐药,10,11,基因芯片（原理）,激光共
3、焦扫描仪,软件判读,样品制备仪,杂交仪,基因芯片方法是基于结核杆菌的利福平和异烟肼耐药性相关的rpoB/katG/inhA的基因位点发生突变，通过PCR扩增、和固定于尼龙膜上的寡核苷酸探针进行杂交、扫描，检测荧光信号的有无，判断特定位点的突变情况和结核菌耐药性。,基因芯片仪和试剂获国家SFDA和欧盟CE认证,12,12,基因芯片法,13,14,利福平的耐药位点,15,同时鉴定MTC与21种NTM,16,非结核分枝杆菌,17,在国内4个省的4个地市级CDC进行了评估。,18,结核病和非结核的诊断,19,特 点,标本：菌株、涂阳痰标本 时间：约8小时优点：高通量灵敏度、特异度高,20,国家结核病参
4、比实验室推荐建议,基因芯片可以用于: 可疑耐药结核病患者筛查,它有望代替利福平和异烟肼的传统药敏试验,推荐理由: 在我国获得注册证书； 国内研究显示其敏感性和特异性较好； 民族品牌 数据显示在我国具有可行性,符合成本效果；,可能使用层级: 地市和省级（医疗机构和疾病预防机构）,21,探针熔解曲线技术,22,工作原理,在一定环境下，DNA双链在其长度和序列一定时，Tm值也一定， 当发生错配时，Tm值下降，下降的幅度与发生错配的碱基数目、类型和位置有关。,Tm,23,96%利福平耐药突变发生在rpoB507-533共81bp区域内,利福平耐药突变检测体系示意图,根据靶序列熔点的变化，检测rpoB基
5、因 是否含有突变，获得利福平耐药信息,24,根据不同的Tm值可以判断出ropB可能不同的碱基发生突变,25,26,根据不同的Tm值可以判断出ropB可能不同的碱基发生突变,27,异烟肼耐药突变检测体系示意图,通过检测 katG315、inhA 启动子和、ahpC 启动子区、inhA94 、密码子的突变与否确定样品对异烟肼的耐药性。,28,根据不同的Tm值可以判断出异烟肼不同的碱基序列发生突变,29,根据不同的Tm值可以判断出异烟肼不同的碱基序列发生突变,30,乙胺丁醇,链霉素,氟喹诺酮,每个突变都表现出特有的谱线 对应独特的熔点, 软件可以自动地给出突变类型,即使发生不均一突变的情况,也可以分
6、辨出来.,31,步骤二加入1-96个提取样本到 检测管中,步骤三集成多重PCR和结果自动报告,步骤一自动提取1-24份样本,操作流程,总耗时约3小时，手工操作时间约15分钟,32,（一）DNA提取,40 min,高质量的样本DNA,33,（二）加入PCR反应管,34,（三）PCR过程和自动判读,35,痰标本纯化DNA qPCR 检测结果,靶序列扩增曲线：,内参扩增曲线：,不同标本的内参扩增结果一致，显示纯化后的DNA溶液对扩增无抑制。,高纯度模板DNA是分子检测可靠性的关键！,36,临床试验结果,此外，在北京胸科医院、广州胸科医院、沈阳胸科医院、乌鲁木齐胸科医院、山东省胸科医院、河南省CDC、厦门市CDC等单位进行临床应用或验证，均获得满意结果。,37,探针熔解曲线技术耐多药检测的评估,38,技术比较,39,40,
