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1、基因工程菌的培养工艺,王林 唐霜 王良蕾 许蔚 徐元坤,发酵生产目的：,1、获得大量外源基因产物,2、减少宿主细胞本身蛋白质的污染,要求外源基因高水平表达,宿主、载体和克隆基因之间的相互关系及其所处的环境条件,培养基为基因工程菌的生长和外源基因的表达提供一切能源物质。培养基的组成既要提高工程菌的生长速率，又要保持重组质粒的稳定性，使外源基因能够高效表达。,碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖及果糖等。使用不同的碳源对菌体生长和外源基因表达有较大的影响。（见教材） 氮源：酵母粉、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆和氨水、硫酸铵、硝酸铵、氯化 铵等。（酪蛋白水解物作为氮源有利于产物的合成和分泌）,其他：无机
2、盐、微量元素、维生素、生物素等，营养缺陷型菌株还要补加相 应的营养物质。无机磷是许多初级代谢的酶促反应的效应因子，（如：DNA、RNA、蛋白质的合成，糖代谢、细胞呼吸、及ATP的水平控制），过量的无机磷会刺激葡萄糖的利用、菌体的生长和氧的消耗，但会影响目的基因的表达。即浓度低影响菌体的生长，浓度高外源基因不表达，故起始磷酸盐浓度应一般控制在0.015mol/L 左右较宜适。 问：为什么启动子只有在低磷酸盐的情况下才被启动？,定义：移入的种子液体积和培养液体积之比。,接种量的大小影响发酵的产量和发酵周期，量小，菌体生长的延迟期长，不利于外源基因的表达；量大，有利于对基质的利用，可以缩短生长延迟期
3、，并使产生菌能迅速占领整个培养环境，减少污染机会，但会使菌体生长过快，代谢产物累积过多，反而会抑制后期菌体的生长；所以实际工作中，接种量的大小应取决于工程菌种在发酵液中的繁殖速度。,在复制水平上 通过调控复制改变基因剂量来影响基因表达在转录水平上 通过影响RNA聚合酶作用/修饰RNA聚合酶来调控基因表达在其他方面 在mRNA降解和翻译水平上影响基因表达 调节细胞内小分子的含量影响细胞内ppGpp（鸟苷四磷酸）的含量量 温敏扩增型质粒（见教材）温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。,大肠杆菌合成青霉素酰化酶不仅受苯乙酸诱导和葡萄糖阻碍，还受温度调控。,16C和18C培养时，菌体生长较慢，从而影响
4、翻译，即酶的合成。,杂交试验分析,结果表明，温度影响了青霉素酰化酶mRNA的浓度。,溶解氧是工程菌发酵培养过程中影响菌体代谢的一个重要参数，溶解氧浓度对菌体生长和产物生成的影响很大。,发酵前期，随DO2的下降，细胞生长减慢，ST值下降；发酵后期，随DO2的下降，ST值下降幅度更大，外源基因高水平转录和翻译，细胞需要更大的能量，需维持较高水平的DO2值(40%)，以促进细胞的呼吸作用，也更利于外源蛋白产物的形成。,Ccr：临界氧浓度，指不影响呼吸所允许的最低氧气浓度。,对于PL或PR启动子型工程菌来说，使用cI阻遏蛋白的温度敏感型突变株（cIts857） 在28-30C下培养时，该突变体能合成有
5、活性的阻遏蛋白阻遏PL或PR启动子的转录 当温度升高到42C时，阻遏蛋白失活，使PL或PR启动子启动转录，提高目的基因转录效率,一般在对数生长期或生长对数期后期升温诱导表达因为此期菌数量多，生长旺盛,对于PL或PR启动子型工程菌来说细胞生长的温度突然升高10以上，细胞内就会产生热激蛋白，以适应环境温度变化。若温度变化幅度不大，热激蛋白合成速度很快又下降，恢复正常蛋白的合成。,问：如何减少热应激蛋白的产生？,热诱导表达的工程菌通过在发酵罐夹层中通热蒸汽，2min内完成升温过程,Notice:如果升温时间过长，则热激蛋白合成剧增，外源蛋白含量相对较低，给后期的纯化造成困难。,PH的变化主要是由工程菌的代谢、培养基的组成、发酵条件来决定。 细胞自身对PH具有一定调节能力，但当外界条件变化过于激烈时，细胞失去自身调节能力，从而影响细胞的正常生长。,如采用两阶段培养工艺：培养前期阶段：着重于优化工程菌的最佳生长条件培养后期阶段：着重于优化外源蛋白的表达条件,总之：必须建立工程菌发酵的最佳化工艺。即指：最快周期、最高产量、最好质量、最低消耗、最大安全性、最周全的废物处理效果与最低失败率等综合指标。,谢谢！,
