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1、FISH痰脱落细胞检查诊断肺癌的价值 王飞。盂涛。杨佳，穆朝东 (新疆医科大学附属肿瘤医院，鸟鲁木齐830011),2012.9 娄全博,摘要：目的 探讨荧光原位杂交技术(FISH)痰脱落细胞检测诊断肺癌的价值。方法 分别采用FISH、常规痰脱落细胞学检查(常规方法)检测60例疑似肺癌患者3、7、17染色体和9号染色体p16位点异常，以病理诊断为金标准，分析FISH、常规方法及二者联合检测诊断肺癌的敏感度和特异度。,结果 病理诊断为肺癌43例，肺良性病变17例。FISH与常规方法诊断肺癌的敏感性分别为65.1、32.5，P=0.003；特异性分别为76.5、100，P= l；常规方法+FISH
2、联合检测的敏感性与特异性分别为72.1、100，与常规方法相比，P分别=0、l。FISH与常规方法检测对TNM分期为I期的敏感性分别为55.6、22.2，P=0.040；IV期的敏感性分别为72、40，P=0.025；常规方法+FISH联合对TNM分期为I期、期的敏感性分别为66.7、76，与常规方法相比，P分别=0.007、0.010。FISH、常规方法及二者联合检测对肺癌分期的诊断特异性无统计学差异。,结论 FISH诊断肺癌的敏感性明显高于常规方法，与常规方法联合检测可显著提高痰液标本诊断肺癌的准确性。,胸片、CT及痰细胞学检查为目前肺癌早期的主要筛查手段，但特异性及敏感性均较低，早期漏诊
3、率高；而大部分肺癌患者就诊时病情已发展到晚期，病死率高。荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)是近年发展起来的一项新技术，其可迅速检测出中期分裂相间期核细胞中染色体数目等异常变化，为肺癌的遗传学研究提供了新方法。本文就采用双色FISH技术检测了60例初诊疑似肺癌患者痰液中脱落细胞3、7、17染色体和9号染色体P16位点异常情况，并以组织病理确诊为肺癌金标准，探讨FISH技术在肺癌诊断中的应用价值。,1.资料与方法 1.1 临床资料 60例初诊疑似肺癌患者，男42例，女18例；年龄4676岁，中位年龄63岁。长期吸烟35例，有慢性咳嗽咳痰病
4、史47例。经病理或细胞学检查诊断证实为肺癌43例(肺癌组)，其中鳞癌26例、小细胞肺癌6例、腺癌11例；TNM分期I一期(早期)18例，期(晚期)25例。肺良性病变17例(良性组)，其中结核10例，肺炎7例。另选取同期20例体检健康者为对照组，年龄4l一80岁，中位年龄61岁。,1.2 痰脱落细胞检查收集三组新鲜痰液标本(取清晨漱口后深部第2、3口痰，连续3d，留置于无菌瓶中)，每例收集约20 mL，分为两等分各10 mL，分别用于FISH检测和常规痰脱落细胞学检查(常规方法)。,1.2.1 FISH检测 标本处理1) 将10ml痰液放入510ml消化液中，摇匀，静置，去上清，离心，留取细胞沉
5、淀2) 加入预热的胶原酶B，吹打，水浴，离心，去上清，再加入预热的0.075molL的KCL低渗液3) 放入37水浴箱低渗30分钟4) 取出后加入新鲜固定液5ml，混匀，静置，离心，去上清5) 缓慢加入5ml固定液，静置10分钟后离心6) 去除上清液加固定液离心（重复23次直到细胞成分洗干净为止）,玻片制备1) 滴制备好的细胞样本到载玻片上（用显微镜观察细胞分布情况）2) （胃蛋白酶工作液）在2SSC（pH 7.0）液中浸泡2分钟3) 依次在70%、85%、100%的乙醇中浸泡2分钟，脱水,1.2.2 对照组痰脱落细胞染色体数目畸变的阈值(畸变率) 对采集的20例正常人痰液每组探针组合分析10
6、0个细胞。统计出现不同异常情况的百分比，阈值=平均数(M)+3标准差(sD)，3、7、17号染色体探针各需要建立2个阈值(1个点、3个点)，9p16探针需要建立3个阈值(0、1、3个点)。任意2个位点出现异常(3号和17号染色体出现非整倍增加)可判断为阳性；一个位点有2种异常(9p16有0信号点异常和3信号点异常)也可判断为阳性。,若只有一个位点出现一种异常，扩大计数细胞后再重新判断。统计信号种类及与之相对应细胞数目百分比并录入图像分析仪。在镜下观察杂交效果，以细胞杂交率80为有效标本。细胞核膜须完整，在细胞核内可见清晰明亮的橘红色或黄绿色荧光信号，如出现2个或3个荧光点，两个位点之间距离大于
7、单个信号的直径以上，且荧光强度相近，计为含有2条或3条染色体。如果两个信号之间的距离1个信号的直径则计数为1条染色体。,正常表现：3(红),7(绿)染色体着丝粒,正常表现：P16(红)位点,17染色体着丝粒(绿),异常表现：出现染色体非整倍体,异常表现：P16(红)缺失，出现染色体非整倍体,1.2.3疑似肺癌患者染色体畸变 20例正常人痰脱落细胞染色体数目畸变的阈值(畸变率)为标准，判定疑似肺癌患者染色体畸变数。每组探针均组合分析100个细胞，计算异常率，判断阳性个数。,2结果20例正常人痰脱落细胞染色体数目畸变的阈值(畸变率)见表1。,2.2诊断价值FISH与常规方法诊断的敏感性分别为65.
8、1(28/43)、32.5(14/43)，P=0.003；特异性分别为76.5(13/17)、100(17/17)，P=1；联合检测的敏感性与特异性分别为72.1(31/43)、100(17/17)，与常规方法比较，P分别=0、1。FISH、常规方法判断TNM分期为I期的敏感性分别为55.6(10/18)、22.2(4/18)，P=0.040； 期敏感性分别为72(18/25)、40(10/25)，P=0.025；联合检测判断I 期、期的敏感性分别为66.7(12/18)、76(19/25)，与常规方法比较，P分别=0.007、0.010；三种方法判断不同分期患者的特异性无统计学差异。,3讨论
9、FISH是一种细胞遗传学与分子生物学相结合的新技术，其采用荧光素直接标记遗传物质DNA制备探针，与染色体或实体肿瘤及脱落细胞间期核进行杂交，通过荧光显微镜观察肿瘤细胞内有无染色体数目和结构的改变；可直接用于检测肺癌患者脱落细胞间期核染色体变化。已有相关文献报道，利用支气管镜检刷取标本进行FISH检测可明显提高早期肺癌检出的敏感性，但支气管镜具有一定创伤性。用FISH技术对痰标本进行肺癌高危人群筛查，对肺癌的发生进行早期干预是目前研究的热点。近年来国内外关于FISH检测痰脱落细胞诊断肺癌的报道较少，且结论差异较大。,本研究FISH结果显示，3，7，17号染色体和9号染色体p16在肺癌组与良性组均
10、发生一定数目的畸变，说明染色体畸变在肺癌发生、发展过程中起重要作用。本研究结果显示，FISH联合常规方法检测诊断肺癌的敏感性为72.1，明显高于常规方法，但特异性无统计学差异。有关报道，通过支气管镜检查疑似肺癌患者得到刷检样本，FISH及联合方法诊断肺癌的敏感性明显高于常规方法，特异性无统计学差异，与本研究结果一致。多色荧光原位杂交技术联合常规方法检测诊断肺癌的敏感性明显高于常规方法。而痰液标本取材容易，无创伤性，有助于推动FISH技术的临床应用。,综上所述，FISH痰脱落细胞检测诊断肺癌的敏感性高，与常规方法联合应用能显著提高准确率。但FISH检测费用较昂贵，操作相对复杂，目前尚不能取代常规方法。,谢谢,
